2.2.1. Hóa chất
Hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu đều là các hóa chất tinh khiết và chuyên dụng. Các hóa chất dùng cho sinh học phân tử phần lớn có nguồn gốc từ các hãng: Sigma (Mỹ), Merck (Đức), Difico (Mỹ), Invitrogen (Mỹ), Fermentas (Đức), Roth (Đức). Các hóa chất dùng cho nuôi cấy, phân tích có nguồn gốc từ Thụy Điển, Trung Quốc, Việt Nam.
Hóa chất dùng cho nuôi cấy: Agar, Glucose, Yeast extract, Peptone, Malt, Malt extraclt.
Hóa chất dùng cho chiết enzyme và thử hoạt tính: Ammonium sulfate, Urea, Potassium dihydrogen phosphate, Calcium chloride, Magnesium sulfate heptahydrate, Cobalt (II) chloride hexahydrate, Tween 80, Cacboxyl metyl cellulose, Congo red.
Hóa chất dùng cho phân tích: 3,5 dinitrosalicylic acid, Sodium hydroxide, Sodium potassium tartrate, Phenol tinh thể, Sodium metabisulfite, Citric acid monohydrate, Glucose.
25
Hóa chất dùng cho điện di protein: Acrylamide, Tris-base, Amonium persulfate, Glycine, Methanol, N’N-bis-methylene-acrylamidde, Clohydric acid, Sodium dodecyl sulfate, Acetic acid.
Hóa chất dùng cho tách chiết và tinh chế DNA: dd SSC 2x, nước cất 2 lần thanh trùng, dd phenol: chloroform (1:1), Kit Silica Bead DNA Gel Extraction (Silica powder suspension, TBE conversion buffer, Concentrated Washing buffer, Binding buffer).
Hóa chất dùng cho PCR: Enzym Taq AND Polymease, dNTPs, thang AND mẫu dùng trong điện di, Agarose dùng trong điện di, Ethidium Bromide để nhuộm gen.
2.2.2. Dụng cụ và trang thiết bị máy móc:
Máy móc, thiết bị: bộ điện din gang (Pharmcia Biotech, Gibico), box cấy (BioblockScientific-Pháp), cân điện tử (Precisa- Thụy Điển), kính hiển vi quang học (Eclipse E600- Nikon- Nhật), lò vi song (LG-Hàn Quốc), máy chụp ảnh gel (Olympus), máy đo pH (Toledo- Anh), máy lắc ồn nhiệt (Eppendorf- Đức), máy li tâm cao tốc (Heraeus- Sepatech), máy PCR (PE-GeneAmp PCR System 9700), máy soi gel (Benchtop UV-Transilluminator VWR), Nồi hấp thanh trùng (Himayatoko-Nhật), máy phá tế bào (Mini Beadbeater-Biospec Products), …
Dụng cụ: Đĩa petri, pipette tự động các loại, ống Falcon, ống nghiệm, ống Eppendorf, ống đong, đèn cồn, bình tam giác (loại từ 20 – 1000), bình schott, que cấy, …
2.3. Thành phần môi trƣờng dùng trong nghiên cứu
2.3.1. Môi trường Czapeck bột giấy
Thành phần
(NH4)2SO4 0.2%
26
KCl 0.05%
MgSO4.7H2O 0.05%
FeSO4.7H2O 0.001%
Agar tinh khiết (BD) 2%
Bột giấy 0.5 %
Tác dụng: dùng làm môi trường phân lập chọn lọc nấm mốc
2.3.2. Môi trường PDA
Thành phần (1000 ml): Glucose (1%), agar (2%), dịch chiết khoai tây.
Dịch chiết khoai tây: 300kg khoai tây đã gọt vỏ, rửa sạch, thái chỉ 50x50x5mm ninh sôi với khoảng 1,5 lít nước máy trong 1 giờ, sau đó lọc bỏ bã lấy đúng 1 lít dịch chiết.
Tác dụng: dùng làm môi trường sạch giống đã được phân lập được.
2.3.3. Môi trường nuôi cấy tách chiết enzyme
Thành phần 1000 ml KH2PO4 4 g (NH4)2SO4 13.6 g CaCl2.2H2O 0.8 g MgSO4.7H2O 0.6g Bacto peptone 6 g Tween 80 0.2ml Cơ chất carbone 20 g Cơ chất carbon: có thể là
27
Bã mía : cám gạo : bã malt = 1 : 1 : 1 Avicel
Bã lúa mì Môi trường vi lượng
Thành phần 1000ml
FeSO4.7H2O 10mg
MnSO4.H2O 3.2mg
ZnSO4.7H2O 2.8mg
CoCl.6H2O 4mg
Tác dụng: làm môi trường nuôi giống để chiết enzyme.
2.3.4. Môi trường YM
Thành phần (200 ml): Yeast extract (0.6 gam), malt extract (0.6 gam), glucose (2 gam), pepton (1 gam), nước cất.
Tác dụng: làm môi trường nuôi giống trước khi PCR.
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp phân lập
Các loại mẫu được lấy ở các địa điểm và thời gian khác nhau. Các mẫu có chứa nấm mốc được pha loãng trong dung dịch muối NaCl 0.9%. Sau đó nấm mốc được phân lập trên môi trường Czapeck bột giấy.
Quy trình tiến hành phân lập như sau:
- Mẫu lấy về cắt nhỏ ở điều kiện vô trùng rồi được pha loãng bằng dung dịch nước muối NaCl 0.9% có trong ống nghiệm, đậy nắp và vortex đều.
28
- Dùng pipet hút 100 µl dịch mẫu vào đĩa petri sau đó đổ môi trường Czapeck bột giấy lên trên. Lắc đều cho hỗn hợp môi trường – mẫu đồng nhất.
- Khi đĩa thạch chuyển sang thể rắn, đổ them một lớp mỏng agar lên trên bề mặt
đĩa.
- Nuôi cấy ở tủ nuôi cấy 30oC trong 7 ngày.
- Sau khi nuôi 7 ngày mang các đĩa peptri ra quan sát. Các khuẩn lạc mốc được
nhặt ra, làm sạch và giữ giống.
2.4.2. Làm sạch giống
Sau khi quan sát các khuẩn lạc trên đĩa thạch phân lập, mỗi đĩa thạch sẽ có một hoặc nhiều khuẩn lạc mốc khác nhau về hình dạng, màu sắc và kích thước. Lấy mỗi loại một vòng que cấy nấm mốc cần làm sạch và cấy ria lên một đĩa petri chứa môi
trường PDA tương ứng, sau đó đem nuôi ở nhiệt độ 30o
C trong 3 - 5 ngày. Tiến hành làm sạch 2-3 lần đến khi thu được chủng nấm mốc tinh sạch.
2.4.3. Quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào:
Các chủng nấm mốc được nuôi cấy trên môi trường thạch đĩa PDA ở 30 oC sau
3 - 5 ngày lấy ra quan sát hình dạng, kích thước, màu sắc khuẩn lạc. Làm tiêu bản và quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi ở vật kính 40x
2.4.4. Tách chiết enzyme
Các chủng nấm mốc phân lập được nuôi cấy trên ống thạch nghiêng PDA trong vòng 3 - 5 ngày cho bào tử mọc dầy. Dùng pipet hút 3000µl Tween vào ống, vortex cho đều. Hút một lượng dịch nhất định trên cho sang bình tam giác chứa môi trường thử hoạt tính sao cho lượng bào tử trong mỗi bình đạt nồng độ 5 x 105 bào tử / ml môi trường. Nuôi lắc ở 170 rpm, nhiệt độ 30o
29
Tùy vào thí nghiệm mà có thể chiết enzyme sau 4, 6, 7, 8, hay 10 ngày nuôi lắc bằng cách ly tâm lạnh ở 40C, 8000 rpm trong vòng 10 phút.
2.4.5. Xác định hoạt tính cellulase (IU) bằng DNS
Cơ chất: giấy lọc được cắt bằng thiết bị đục giấy, mỗi mảnh khoảng 2.22 mg. Enzyme được pha loãng tới nồng độ thích hợp bằng đệm Na-citrate 0.05 M pH 4.8
Mẫu thí nghiệm:
Cho vào eppendorf khoảng 10-11 mg giấy lọc (khoảng 5 mảnh) + 0.2 ml đệm
Na-citrate 0.05 M pH 4.8 để dung dịch đệm thấm ướt hoàn toàn mảnh giấy, giữ 50oC trong 5 phút.
Bổ sung vào eppendorf chứa cơ chất 0.1 ml dịch enzyme (mẫu đã pha loãng với
tỉ lệ thích hợp), cho enzyme phản ứng với cơ chất ở 50oC chính xác trong 60 phút.
Bổ sung ngay 0.6 ml DNS để ngừng phản ứng. Phản ứng màu ở 100o C trong 5
phút, làm lạnh nhanh bằng nước đá.
Lấy 0.2 ml dịch phản ứng và 0.9 ml nước cất, mix đều.
Đo OD ở bước sóng 540 nm.
Mẫu đối chứng thí nghiệm: Các bước làm giống như mẫu thí nghiệm tuy nhiên ở bước 2 dịch enzyme đã bất hoạt (đun sôi enzyme trong 5 – 10 phút)
Mẫu blank: Cho vào eppendof 0.3 ml đệm Na – citrate 0.05 M pH 4.8 .Gia nhiệt ở 50o
C trong 60 phút. Làm tiếp giống mẫu thí nghiệm từ bước 3- 5.
Mẫu đối chứng dương: (dùng enzyme thương phẩm) phân tích 1 mẫu Novozym 50013 pha loãng tới 500 – 1000 lần.
30
Hoạt tính cellulose (IU/ml) được tính bằng số µmol D – glucose tạo ra khi thủy
phân giấy lọc trong một phút bởi 1 ml enzyme ở pH 4.8, nhiệt độ 50oC.
IU = (y1 -y0)*D*0.3/0.18*60*0.1 = a*(x1 - x0)*D*0.278
y1: Nồng độ D -glucose của mẫu thí nghiệm (mg) y0: Nồng độ D -glucose của mẫu đối chứng (mg) x1: OD của mẫu thí nghiệm
x0: OD của mẫu đối chứng D: hệ số pha loãng
a: hệ số của đường chuẩn y = ax + b
0.18: 180/1000 của đường D - glucose khan 60: thời gian phản ứng (phút)
0.3: tổng thể tích enzyme + cơ chất (ml) 0.1: thể tích enzyme tham gia phản ứng (ml)
2.4.6. Xác định hoạt tính Xylanase theo phương pháp DNS
Cơ chất xylan 1% 0.5 g xylan birchwood pha trong 50 ml dung dịch đệm Natri –
citrate 0.05 M pH 4.8 thanh trùng 121oC trong 20 phút , bảo quản ở 4 oC. Enzyme được pha loãng tới nồng độ thích hợp bằng đệm Natri – citrate 0.05 M pH 4.8.
Mẫu thí nghiệm:
Hút 0.2 ml cơ chất vào eppendorf, giữ ở 50 o
C trong 5 phút.
Bổ sung 0.1 ml dịch enzyme (mẫu đã pha loãng với tỷ lệ thích hợp), cho enzyme phản ứng với cơ chất ở 50 oC trong 20 phút.
31
Bổ sung 0.6 ml DNS để ngừng phản ứng. Phản ứng màu ở 100 oC trong 5 phút,
làm lạnh nhanh bằng nước đá.
Li tâm ở 10000 rpm trong 1 phút. Lấy 0.2 ml dịch phản ứng trong mix đều với
0.9 ml nước cất.
Đo OD ở bước sóng 540 nm.
Mẫu đối chứng thí nghiệm: Các bước làm giống như mẫu thí nghiệm, tuy nhiên ở bước 2 dịch enzyme bị bất hoạt (enzyme được gia nhiệt ở 100 o
C trong 10 phút).
Mẫu blank: cho vào eppendorf 0.3 ml đệm Natri – citrate 0.05 M pH 4.8. Gia nhiệtở 50 oC trong 60 phút. Làm tiếp giống mẫu thí nghiệm từ bước 3 đến bước 5.
Mẫu đối chứng dương: Phân tích 1 mẫu enzyme thương phẩm.
Hoạt tính xylanase (IU/ml) được tính bằng số µmol D – xylose tạo ra khi thuỷ phân xylan trong một phút bởi 1 ml enzyme ở pH 4.8, nhiệt độ 50 oC
IU = (y1 -y0)*D*0.3/0.15*20*0.1 = a*(x1 - x0)*D
y1: Nồng độ xylose của mẫu thí nghiệm (mg) y0: Nồng độ xylose của mẫu đối chứng (mg) x1: OD của mẫu thí nghiệm
x0: OD của mẫu đối chứng D: hệ số pha loãng
a: hệ số của đường chuẩn y = ax + b
0.15: 150/1000 của đường D - xylose khan 20: thời gian phản ứng (phút)
32
0.3: tổng thể tích enzyme + cơ chất (ml) 0.1: thể tích enzyme tham gia phản ứng (ml)
2.4.7. Định lượng protein theo phương pháp Lowry
Nguyên tắc: Hầu hết các protein đều chứa Tyrosin và Tryptophan. Hàm lượng của những acid amin này tùy thuộc vào loại protein. Vì vậy, những protein cùng một loại với nhau có hàm lượng các acid amin này giống nhau.
Khi cho protein tác dụng với thuốc thử Folin sẽ tạo thành một phức chất có màu. Cường độ màu của phức này tỉ lệ với hàm lượng Tyrosin và Tryptophan (cũng là hàm lượng protein). Vì thế, có thể dùng phương pháp so màu để xác định hàm lượng protein
Chuẩn bị:
- Dung dịch A: 10g sodium carbonate (Na2CO3) pha trong 500ml NaOH 0.1N
- Dung dịch B: 0.5g CuSO4.5H2O trong 100ml potassium sodium tartrate 1%
- Dung dịch C: chuẩn bị trước khi làm thí nghiệm bằng cách pha dung dịch A và
dung dịch B với nhau theo tỷ lệ 50 : 1
- Thuốc thử Folin – ciocalteu : nước cất theo tỷ lệ 1 : 1 Tiến hành:
- Bước 1: Hút 0.2 ml dịch chiết enzyme (pha loãng vơi tỷ lệ thích hợp) và 1ml
dung dịch C vào eppendorf
- Bước 2: mix đều hỗn hợp và để 10 phút ở nhiệt độ phòng
- Bước 3: Bổ sung 0.1 ml folin – ciocalteu
- Bước 4: mix đều, để nhiệt độ phòng trong 30 phút
- Bước 5: Đo OD ở bước sóng 660 nm
Mẫu Blank: Cho vào eppendorf 0.2 ml nước cất và 1 ml dung dịch C, sau đó tiến hành các bước tương tự như mẫu thí nghiệm.
33
Dựng đường chuẩn:
Stock bovine serum albumin solution (BSA) 10mg/ml được pha ra các nồng độ 50, 100, 200, 300, 400 và 500 µg/ml
No. BSA (µg/ml) Stock solution of BSA (µl) Distilled water (µl) Final volumn (µl) 1 0 0 1000 1000 2 50 5 995 1000 3 100 10 990 1000 4 200 20 980 1000 5 300 30 970 1000 6 400 40 960 1000 7 500 50 950 1000
Hàm lượng protein trong mẫu dịch chiết enzyme được tính theo công thức:
Protein (µg/ml) = (OD660 / a) * n
a: hệ số y = ax + b của đường chuẩn n: hệ số pha loãng
2.4.8. Điện di protein
Phƣơng pháp điện di SDS - PAGE
STT Hoá chất Running gel 10% Stacking gel 5 %
1 Nước cất 3 ml 1.385 ml 2 30 % Acrylamide 2.5 ml 0.415 ml 3 1.5 M Tris – HCl 1.9 ml ( pH 8.8 ) 0.62 ml ( pH 6.8) 4 10% SDS 80 µl 25 µl 5 30% APS 15 µl 7.5µl 6 TEMED 15µl 7.5µl
34
Chuẩn bị mẫu: Mẫu chiết enzyme thô được ly tâm 10000 rpm trong 5 phút. Sau đó mang cô đặc chân không trong ống eppendorf. Pha mẫu với loading dye theo tỉ lệ 4:
1. Lắc đều và gia nhiệt 4 phút ở 95 oC. Sau đó ly tâm 10000 rpm trong 30 giây. Mẫu
chuẩn bị xong phải điện di ngay hoặc để không quá 2 ngày ở 20 oC.
Chuẩn bị gel : Sau khi lắp kính thật khít, cài luợc vào khuôn và đánh dấu bên ngoài để mép gel cách chân lược khoảng 0.4 cm, đổ lớp running gel trước, chờ cho đến khi lớp gel này đông lại thì đổ tiếp lớp stacking gel và gắn lược, chờ 30 phút để gel đông. Đặt bản gel vào buồng điện di, đổ dung dịch điện giải đến vạch quy định của thiết bị, gỡ lược loại bỏ các mẫu gel thừa bên trên giếng nhằm tạo cho giếng sạch để load mẫu được dễ dàng.
Loading mẫu: Mẫu đã chuẩn bị ở trên được load vào giếng với thể tích thích hợp. Đánh dấu thứ tự các giếng vào sổ để phân biệt được các mẫu. Chạy 120 V. Khi mẫu chạy cách mép dưới của gel còn 0.5 cm nữa thì dừng máy. Gỡ gel khỏi máy.
Tiến hành nhuộm gel:
Nhuộm gel trong 50 ml CBB ở 50 oC trong 1 giờ hoặc lâu hơn để CBB bắt mầu
với protein.
Tẩy màu bằng 50ml dung dịch tẩy I ở nhiệt độ thường, kèm theo lắc nhẹ trong
vòng 30 phút.
Ngâm gel trong 50 ml dung dịch tẩy II ở nhiệt độ thường trong vòng 30 phút,
kèm theo lắc nhẹ, lặp lại hai lần.
Quan sát, chụp ảnh hoặc scan gel để lưu kết quả.
Phƣơng pháp điện di Zymogram
Thành phần gel: Thành phần gel tương tự như phương pháp điện di SDS – PAGE nhưng ở lớp running gel thay nước cất bằng cơ chất CMC và xylan.
35
Tiến hành: Tiến hành tương tự như điện di SDS – PAGE nhưng phần nhuộn gel làm như sau:
Ngâm gel trong 100 ml 2% Triton X – 100, lắc 30 phút (làm 2 lần).
Ngâm gel trong 100 ml dung dịch đệm (0.1 M natri acetate, pH 5) lạnh, lắc 15
phút (làm 2 lần).
Ngâm gel trong 100 ml dung dịch đệm (0.1 M natri acetate, pH 5) ấm, 30 phút ở
50 oC (hoặc lâu hơn đến 12 giờ)
Nhuộm gel trong 100 ml dung dịch Congo red 0.1 %, lắc 30 phút.
Cố định màu bằng cách rửa gel trong 200ml NaCl 1M, rửa 2 lần, mỗi lần 15
phút.
Quan sát, chụp ảnh hoặc scan gel để lưu kết quả
2.4.9. Phương pháp finger printing
Phương pháp tách chiết AND tế bào nấm mốc
Tế bào nấm mốc được nuôi lắc trong môi trường YM dịch ở 30 oC trong 2-3 ngày. Lấy 2 vòng que cấy tế bào cho vào eppendorf vô trùng và thêm 750 µl SSC 2x
vào mỗi ống. Lắc đều và đun ở 100 oC trong 10 phút. Ly tâm 12000 rpm trong 1 phút.
Hút bỏ phân dịch và tiến hành rửa tế bào 2 lần bằng nước cất vô trùng. Qua mỗi lần rửa ly tâm 12000 rpm trong 1 phút, loại bỏ dịch nổi. Thêm 100 µl nước cất vô trùng, 100 µl hạt thuỷ tinh , 150 µl phenol/chloroform (tỷ lệ 1:1), đặt vào máy phá tế bào trong 1 phút. Đem ly tâm ở 12000 rpm trong 10 phút. Lấy phần dịch trong phía trên có chứa DNA và giữ ở - 20oC.
Phương pháp tinh chế DNA
Do DNA của nấm mốc còn chứa nhiều chất ức chế PCR nên trước khi dùng DNA làm khuôn cho phản ứng PCR, chúng tôi tiến hành tinh chế DNA bằng Silica bead DNA Gel extraction Kit. Hút 50 µl dịch trong chứa DNA cho vào Eppendorf vô
36
trùng. Bổ sung 150 µl dung dịch Binding buffer có chứa silica. Đem ly tâm ở 12000 rpm trong 2 phút. Hút bỏ dịch do DNA đã bám trên bề mặt các hạt thuỷ tinh. Rửa 3 lần bằng washing buffer. Sau đó phơi khô rồi bổ sung 15 µl nước cất vô trùng dùng cho PCR. Ly tâm ở 12000 rpm trong 1 phút. DNA ở phần dịch nổi là DNA đã được tinh chế. DNA sau khi tinh chế có thể dùng làm khuôn cho phản ứng PCR, phần còn lại giữ ở - 20 o
C.
Phương pháp tiến hành phản ứng PCR finger printing
Phản ứng PCR fingerprinting được tiến hành với thành phần phản ứng:
Tuỳ vào các mục đích khác nhau thể tích thành phần phản ứng có thể thay đổi khi đó thể tích của các thành phần được điều chỉnh sao cho tỉ lệ giữa chúng không thay đổi. Sau khi trộn các thành phần phản ứng như trên, phản ứng được tiến hành trên máy PE – geneamp PCR system 9700 với chu trình nhiệt thích hợp.
Tiến hành nhân đoạn DNA bằng kĩ thuật PCR sử dụng mồi MST2 trên máy Gene Amp, System 9700 (PE), chương trình MST2. Chu trình gia nhiệt như sau:
– Biến tính 94oC trong vòng 2 phút.
Đệm phản ứng ( 10x) 10µl
MgCl2 ( 25 mM ) 4µl
dNTPs ( 20 mM mỗi loại ) 2µl
Mồi MST2 ( GAC)5 ( 20 µM ) 4µl
Taq DNA polymerase ( 5u/µl) 0.5µl
DNA khuôn 1.5µl
Nước dùng cho PCR 78µl
37
– Tiếp theo mẫu được nhân lên bởi 35 chu kì liên tiếp với các bước: biến tính ở
94oC trong vòng 40 giây, gắn mồi ở 52 oC trong vòng 1 phút 30 giây và kéo dài ở 72 o
C trong 2 phút .
Phương pháp điện di