Cơ chất: giấy lọc được cắt bằng thiết bị đục giấy, mỗi mảnh khoảng 2.22 mg. Enzyme được pha loãng tới nồng độ thích hợp bằng đệm Na-citrate 0.05 M pH 4.8
Mẫu thí nghiệm:
Cho vào eppendorf khoảng 10-11 mg giấy lọc (khoảng 5 mảnh) + 0.2 ml đệm
Na-citrate 0.05 M pH 4.8 để dung dịch đệm thấm ướt hoàn toàn mảnh giấy, giữ 50oC trong 5 phút.
Bổ sung vào eppendorf chứa cơ chất 0.1 ml dịch enzyme (mẫu đã pha loãng với
tỉ lệ thích hợp), cho enzyme phản ứng với cơ chất ở 50oC chính xác trong 60 phút.
Bổ sung ngay 0.6 ml DNS để ngừng phản ứng. Phản ứng màu ở 100o C trong 5
phút, làm lạnh nhanh bằng nước đá.
Lấy 0.2 ml dịch phản ứng và 0.9 ml nước cất, mix đều.
Đo OD ở bước sóng 540 nm.
Mẫu đối chứng thí nghiệm: Các bước làm giống như mẫu thí nghiệm tuy nhiên ở bước 2 dịch enzyme đã bất hoạt (đun sôi enzyme trong 5 – 10 phút)
Mẫu blank: Cho vào eppendof 0.3 ml đệm Na – citrate 0.05 M pH 4.8 .Gia nhiệt ở 50o
C trong 60 phút. Làm tiếp giống mẫu thí nghiệm từ bước 3- 5.
Mẫu đối chứng dương: (dùng enzyme thương phẩm) phân tích 1 mẫu Novozym 50013 pha loãng tới 500 – 1000 lần.
30
Hoạt tính cellulose (IU/ml) được tính bằng số µmol D – glucose tạo ra khi thủy
phân giấy lọc trong một phút bởi 1 ml enzyme ở pH 4.8, nhiệt độ 50oC.
IU = (y1 -y0)*D*0.3/0.18*60*0.1 = a*(x1 - x0)*D*0.278
y1: Nồng độ D -glucose của mẫu thí nghiệm (mg) y0: Nồng độ D -glucose của mẫu đối chứng (mg) x1: OD của mẫu thí nghiệm
x0: OD của mẫu đối chứng D: hệ số pha loãng
a: hệ số của đường chuẩn y = ax + b
0.18: 180/1000 của đường D - glucose khan 60: thời gian phản ứng (phút)
0.3: tổng thể tích enzyme + cơ chất (ml) 0.1: thể tích enzyme tham gia phản ứng (ml)