Cơ chất xylan 1% 0.5 g xylan birchwood pha trong 50 ml dung dịch đệm Natri –
citrate 0.05 M pH 4.8 thanh trùng 121oC trong 20 phút , bảo quản ở 4 oC. Enzyme được pha loãng tới nồng độ thích hợp bằng đệm Natri – citrate 0.05 M pH 4.8.
Mẫu thí nghiệm:
Hút 0.2 ml cơ chất vào eppendorf, giữ ở 50 o
C trong 5 phút.
Bổ sung 0.1 ml dịch enzyme (mẫu đã pha loãng với tỷ lệ thích hợp), cho enzyme phản ứng với cơ chất ở 50 oC trong 20 phút.
31
Bổ sung 0.6 ml DNS để ngừng phản ứng. Phản ứng màu ở 100 oC trong 5 phút,
làm lạnh nhanh bằng nước đá.
Li tâm ở 10000 rpm trong 1 phút. Lấy 0.2 ml dịch phản ứng trong mix đều với
0.9 ml nước cất.
Đo OD ở bước sóng 540 nm.
Mẫu đối chứng thí nghiệm: Các bước làm giống như mẫu thí nghiệm, tuy nhiên ở bước 2 dịch enzyme bị bất hoạt (enzyme được gia nhiệt ở 100 o
C trong 10 phút).
Mẫu blank: cho vào eppendorf 0.3 ml đệm Natri – citrate 0.05 M pH 4.8. Gia nhiệtở 50 oC trong 60 phút. Làm tiếp giống mẫu thí nghiệm từ bước 3 đến bước 5.
Mẫu đối chứng dương: Phân tích 1 mẫu enzyme thương phẩm.
Hoạt tính xylanase (IU/ml) được tính bằng số µmol D – xylose tạo ra khi thuỷ phân xylan trong một phút bởi 1 ml enzyme ở pH 4.8, nhiệt độ 50 oC
IU = (y1 -y0)*D*0.3/0.15*20*0.1 = a*(x1 - x0)*D
y1: Nồng độ xylose của mẫu thí nghiệm (mg) y0: Nồng độ xylose của mẫu đối chứng (mg) x1: OD của mẫu thí nghiệm
x0: OD của mẫu đối chứng D: hệ số pha loãng
a: hệ số của đường chuẩn y = ax + b
0.15: 150/1000 của đường D - xylose khan 20: thời gian phản ứng (phút)
32
0.3: tổng thể tích enzyme + cơ chất (ml) 0.1: thể tích enzyme tham gia phản ứng (ml)