2.2.1. Lập hồ sơ bệnh án
Các cặp vợ chồng được chẩn đoán là vô sinh nguyên phát được thăm khám lâm sàng, khai thác tiền sử gia đình (có người nào bị vô sinh không), tiền sử bản thân (có mắc các bệnh mãn tính như viêm gan siêu vi trùng, bệnh đái tháo đường… và có bị chấn thương bộ phận sinh dục hay không), khai thác về tuổi, nghề nghiệp, môi trường làm việc, tiền sử mắc bệnh, nhiễm độc, quai bị, nghiện rượu, thuốc lá.
2.2.2. Phương pháp phân tích nhiễm sắc thể và lập karyotyp
2.2.2.1. Nuôi cấy tế bào bạch cầu lympho máu ngoại vi theo phương pháp của Hungerford D.A. (1960)[55] Hungerford D.A. (1960)[55]
- Lấy 2ml máu tĩnh mạch cho vào ống li tâm đã được tráng bằng heparin và đậy nút cao su kín
- Các bước nuôi cấy phải được thực hiện trong buồng nuôi cấy tế bào trong điều kiện vô trùng.
- Dùng ống hút nhỏ giọt pipet Pasteur cho từ 6 – 8 giọt máu toàn phần vào tuýp nuôi cấy có chứa 6ml môi trường nuôi cấy F10 hoặc F12, 2ml huyết thanh bê và 0,1ml PHA ( phytohemagglutinin).
- Đậy nắp rồi để tuýp nuôi cấy trong tủ ấm 37oC thời gian 72 giờ.
2.2.2.2. Phương pháp làm tiêu bản nhiễm sắc thể
* Xử lý colchicine
- Tế bào nuôi cấy trong tủ ấm đến giờ thứ 70 thì bổ sung vào tuýp nuôi cấy 1ml dung dịch colchicine với nồng độ 1µg/1ml để tích lũy nhiều cụm kỳ giữa
- Tuýp nuôi cấy được li tâm với tốc độ 800 – 1000 vòng/1 phút thời gian 10 phút.
- Sau khi ly tâm dùng pipet pasteur loại bỏ dịch nổi ở phía trên giữ lại phần cặn lắng chứa các tế bào
- Cho từ từ 30ml dung dịch nhược trương KCl 0,075 M vào tuýp nuôi cấy - Lắc nhẹ và để trong tủ ấm 37oC thời gian khoảng 45 phút.
- Li tâm, loại bỏ phần dịch phía trên, giữ lại phần cặn chứa nhân tế bào và các cụm NST ở kỳ giữa.
* Cố định tế bào
- Nhỏ từ từ dung dịch cố định Carnoy (3 methanol : 1 acid acetic ) vào tuýp nuôi cấy
- Sau đó li tâm loại bỏ dịch nổi ở phía trên (3 lần).
- Lần cuối cùng sau khi nhỏ dung dịch carnoy đem li tâm và loại bỏ dịch ở phía trên giữ lại khoảng 0,5ml dung dịch để nhỏ tiêu bản.
* Lên tiêu bản
- Dùng ống hút nhỏ giọt pipet Pasteur hút lấy phần cặn chứa nhân tế bào và các cụm kỳ giữa và dàn tế bào đều lên lam kính sạch đã được để lạnh.
- Để tiêu bản khô tự nhiên rồi tiến hành nhuộm tiêu bản.
2.2.2.3. Phương pháp nhuộm tiêu bản bằng băng G theo phương pháp của Seabright M. ( 1971)[73] Seabright M. ( 1971)[73]
Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất:
Dụng cụ: 5 cốc thủy tinh loại 100ml để đựng hóa chất và thuốc nhuộm, 2 cốc mỏ thủy tinh loại 500ml đựng nước rửa tiêu bản.
Hóa chất: NaCl 0,15N, Trypsin 1: 250 (Difco) KH2PO4, Na2HPO42H2O, Giemsa.
Cách pha hóa chất:
Dung dịch Trypsin mẹ 5%
Dung dịch Trypsin sử dụng: 1 ml dung dịch Trypsin mẹ 49 ml dung dịch NaCl 0,15N Dung dịch đệm photphat KH2PO4 : 3,56g/1 lít
Dung dịch Giemsa 4%: 2 ml dung dịch Giemsa mẹ
48 ml dung dịch đệm photphat pH 6,8
Các bước tiến hành được thực hiện trong điều kiện ở nhiệt độ phòng thí nghiệm: Nhúng tiêu bản vào cốc đựng dung dịch NaCl 0,15N thời gian khoảng 25 – 30 giây.
Sau đó tiêu bản được cho vào một cốc khác đựng dung dịch Trypsin 0,1% (Difco 1: 250).
Rửa tiêu bản lặp lại 2 lần trong một cốc đựng dung dịch NaCl 0,15N.
Tiêu bản được nhuộm bằng thuốc nhuộm Giemsa 4% pH = 7, thời gian 10 phút. Tất cả các tiêu bản sau khi nhuộm xong được rửa trong 2 cốc đựng nước máy hoặc dưới vời nước máy chảy nhẹ. Kiểm tra độ phân vùng của NST dưới kính hiển vi quang học, rồi sau đó để tiêu bản khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng thí nghiệm.
2.2.2.4. Phương pháp phân tích nhiễm sắc thể và lập karyotyp: theo tiêu chuẩn ISCN (2009) [74] ISCN (2009) [74]
Phân tích NST được thực hiện dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần. Mỗi cặp vợ chồng được phân tích NST:
- Với tiêu bản nhuộm băng G, chúng tôi phân tích 20 cụm kỳ giữa bao gồm: đếm số lượng NST, phát hiện những bất thường cấu trúc và số lượng của NST. Trường hợp thể khảm có thể phân tích 100 cụm kỳ giữa.
- Tiêu chuẩn đánh giá: quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại x1000, tìm các cụm NST của tế bào đang phân chia ở kỳ giữa. Sau đó chọn các cụm có các NST trải đều trên một diện tích và tạo thành một đám tròn tương đối đều đặn, các NST không chồng chất lên nhau có thể phân biệt được từng chiếc và đếm chính xác số lượng NST của từng cụm. Quan sát kỹ và phát hiện những bất thường về cấu trúc và số lượng NST
Lập karyotyp: Mỗi bệnh nhân được chọn 3 cụm kỳ giữa và lập karyotyp trên phần mềm của vi tính theo tiêu chuẩn ISCN – 2009 (An International System for
Human Cytogenetic Nomenclature) .
Tổng hợp các số liệu đã quan sát rồi kết luận về số lượng và cấu trúc của bộ NST.
2.2.3. Xử lý số liệu
Các số liệu phân tích NST và lập karyotyp ở 187 cặp vợ chồng được mã hóa nhập vào máy vi tính, xử lý và kiểm tra độ chính xác bằng các phương pháp thống kê Y học. Số liệu được xử lý và phân tích bằng chương trình Microsoft Excel 2007. Các ứng dụng:
- Các hàm tính toán: SUM, AVERAGE, STDEV, MIN, MAX…. - Vẽ đồ thị và biểu đồ.
Chương 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Trong thời gian từ tháng 6/2010 đến tháng 6/2012, tổng số 187 cặp vợ chồng đã được khám lâm sàng tại bệnh viện Phụ sản Trung Ương, bệnh viện Phụ sản Hà Nội, Khoa sản bệnh viện Bạch Mai… đã gửi đến bộ môn Y sinh học – Di truyền, trường Đại học Y Hà Nội yêu cầu xét nghiệm NST, phân tích và lập karyotyp, chúng tôi thu được kết quả như sau:
3.1. Tuổi của các cặp vợ chồng vô sinh nguyên phát
Tổng số 187 cặp vợ chồng (374 trường hợp) bị vô sinh nguyên phát. Trong đó: - Tuổi của người vợ thấp nhất là 21 tuổi, cao nhất là 44 tuổi, trung bình 29,78±5
- Tuổi của người chồng thấp nhất là 22 tuổi, cao nhất là 51 tuổi, trung bình 32,65±5,34
Bảng 1. Sự phân bố theo tuổi của các cặp vợ chồng vô sinh nguyên phát Tuổi Vợ Chồng Số lượng (n) Tỷ lệ (%) Số lượng (n) Tỷ lệ (%) 20-24 19 10,16 5 2,67 25-29 77 41,18 49 26,20 30-34 61 32,62 69 36,90 35-39 25 13,37 41 21,93 ≥40 5 2,67 23 12,30 Tổng 187 100 187 100 Nhận xét:
Tỷ lệ vô sinh ở người vợ chiếm tỷ cao ở nhóm tuổi từ 25-29 có 77 trường hợp (41,18%) và thấp nhất ở nhóm tuổi ≥40 có 5 trường hợp (2,67%)
Người chồng vô sinh chiếm tỷ lệ cao trong nhóm tuổi 30-34 có 69 trường hợp (36,90%) và thấp nhất là nhóm tuổi 20-24 có 5 trường hợp (2,67%).
karyotyp ở những cặp vợ chồng vô sinh nguyên phát đã cho thấy tuổi của người vợ hoặc người chồng cũng có ảnh hưởng đến khả năng sinh sản:
Menken và cs (1986) cho rằng: Khả năng sinh sản của nữ giới giảm dần theo tuổi, đặc biệt sau tuổi 35. Tỷ lệ vô sinh ở các nhóm tuổi tăng dần như sau: Nhóm tuổi 20-24 là 7%; 25-29 là 9%; 30-34 là 15%; 35-39 là 22% và 40-44 là 29% [49]
Stovall và cs (1991), đã chứng minh khả năng sinh sản của vợ chồng phụ thuộc vào tuổi của nữ giới hơn nam giới, tỷ lệ nữ giới đã lập gia đình mà không có con tăng lên đều đặn: 6% ở nhóm tuổi 20-24; 9% ở nhóm tuổi 25-29; 15% ở nhóm tuổi 30-34; 30% ở nhóm tuổi 35-39 và 64% ở nhóm tuổi 40-44 [80]
Franco và cs (2002) cho biết, trong 251 cặp vợ chồng vô sinh thì vô sinh nam giới chiếm 45%, vô sinh nữ giới chiếm 48%, vô sinh do cả nam và nữ là 7%. Trong đó, vô sinh nguyên phát chiếm 74% và vô sinh thứ phát chiếm 26%. Tuổi trung bình của nữ giới là 34±4,2 và của nam giới là 36,8±6,5 [26]
Theo S.L. Yu và C. Yap (2003) thì ước tính tỷ lệ vô sinh ở độ tuổi từ 25-29 là 5,5%; độ tuổi từ 30-34 là 9,5% và từ 35-39 tăng cao chiếm 19,7% [91]
David và cs (2004) nghiên cứu 782 cặp vợ chồng ở 7 trung tâm Châu Âu. Kết quả cho thấy có các cặp vợ chồng càng lớn tuổi thì tỷ lệ vô sinh càng cao, tỷ lệ vô sinh ở nhóm tuổi từ 19-26 chiếm 8%, từ 27-34 chiếm 13-14% và nhóm tuổi 35-40 chiếm tỷ lệ cao 18%.
Maheshwari và cs (2007) nghiên cứu 7172 phụ nữ, 26,9% đã qua tuổi 35, tuổi trung bình là 31,2±5,2 cho thấy có 51,4% vô sinh nguyên phát và vô sinh không rõ nguyên nhân ở phụ nữ trên 35 tuổi cao hơn so với phụ nữ dưới 30 tuổi [45].
Roupa và cs (2009) đã nghiên cứu 110 phụ nữ vô sinh, về độ tuổi cho thấy: 71 trường hợp (64,5%) ở độ tuổi từ 20-29; 22 trường hợp (20%) ở độ tuổi từ 30-39; 13 trường hợp (11,8%) ở độ tuổi từ 40-49; 4 trường hợp (3,7%) có độ tuổi lớn hơn 50 tuổi [72].
cặp vợ chồng (5,52%) vô sinh, trong đó có 170 trường hợp (3,48%) vô sinh nguyên phát và 107 trường hợp (2,04%) vô sinh thứ phát. Tuổi trung bình của nam giới vô sinh là 45,38±15,18, tuổi trung bình của nữ giới là 39,90±14,20 [14]
George và Kamath (2010), cho rằng tuổi sinh sản bắt đầu giảm từ tuổi 32 và giảm đáng kể ở tuổi 37 [27]
Bushnik và cs (2011), nghiên cứu các cặp vợ chồng đã lập gia đình ở Canada từ năm 2009-2011 trong độ tuổi ở nữ giới từ 18 đến 44 tuổi. Ước tính tỷ lệ vô sinh hiện nay dao động từ 11,5% đến 15,7%. Và tỷ lệ vô sinh cao hơn ở nhóm tuổi 35-44 so với nhóm tuổi 18-34 [17]
Theo Punam Nagvenkar, nghiên cứu trên 88 bệnh nhân vô sinh nam giới ở Mumbai (Ấn Độ) có tuổi từ 26 đến 50 thì tuổi trung bình là 34,5 [53] . Jon L. Pryor và cs., nghiên cứu trên 200 bệnh nhân vô sinh nam giới có tuổi từ 24 đến 52, tuổi trung bình là 34 [63]. Robert và cs., nghiên cứu trên 42 bệnh nhân KCTT và ITT có tuổi từ 24 đến 53, tuổi trung bình là 34 [56]. Comhair và cs., lại thấy rằng tuổi trung bình của nhóm bệnh nhân vô sinh nam giới do KCTT và ITT là 31,1 [21].
Nhìn chung theo thống kê của các tác giả trên thế giới thì độ tuổi trung bình của vô sinh ở nam giới thường là từ 30 đến 35, còn ở nữ giới là từ 20 đến 30 tuổi. Theo chúng tôi, tuổi trung bình của các bệnh nhân vô sinh khác nhau ở từng nghiên cứu có thể do nhiều nguyên nhân, trong đó có tiêu chuẩn lựa chọn khoảng giới hạn tuổi bệnh nhân khác nhau của mỗi tác giả hoặc phụ thuộc vào số người đến khám và làm xét nghiệm NST, do sự phân bố giới hạn của tuổi khác nhau và do phong tục, tập quán ở mỗi vùng khác nhau... Ngoài ra, ở nhiều nước phương Tây, độ tuổi xây dựng gia đình thường cao hơn ở Việt Nam, do đó độ tuổi trung bình của các cặp vợ chồng vô sinh cũng cao hơn.
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy tuổi người vợ chiếm tỷ lệ cao nhất ở nhóm 25-29 tuổi có 77 trường hợp chiếm tỷ lệ 41,18%, còn tuổi ở người chồng chiếm tỷ lệ cao là 30-34 tuổi có 69 trường hợp (36,90%). Tiếp theo nhóm chiếm tỷ lệ cũng
tương đối cao ở người vợ là nhóm từ 30-34 có 61 trường hợp (32,62%) và nhóm tuổi 25-29 ở người chồng có 49 trường hợp (26,20%). Nhóm tuổi đứng thứ 3 ở người vợ là từ 35-39 tuổi (13,37%) và người chồng là nhóm 35-39 tuổi (21,93%). Nhóm tuổi có tỷ lệ thấp thứ 4 là nhóm 20-24 ở người vợ (10,16%), còn ở người chồng là nhóm ≥40 tuổi (12,30%). Và nhóm có tỷ lệ thấp nhất ở người vợ là nhóm ≥40 chiếm tỷ lệ 2,67%, còn ở người chồng là nhóm 20-24 cũng chiếm tỷ lệ 2,67%. Theo chúng tôi kết quả trên là hoàn toàn hợp lý, bởi lẽ ở Việt Nam độ tuổi nữ từ 25-29 là độ tuổi xây dựng gia đình phổ biến nhất ở nữ giới hiện nay. Hơn nữa bình thường các cặp vợ chồng ở độ tuổi này sau khi xây dựng gia đình thường muốn có con ngay nên sau một, hai năm không có con là họ đi khám vô sinh và chỉ định xét nghiệm NST, do đó các cặp vợ chồng vô sinh thường được phát hiện ở nhóm tuổi này. Nhóm tuổi 30-34 ở người chồng chiếm tỷ lệ cao, theo chúng tôi, ngày nay theo xu hướng càng nhiều người xây dựng gia đình muộn nhất là ở khu vực thành thị và thường sau một, hai năm họ mới đi khám và được chỉ định xét nghiệm NST. Ở người vợ nhóm có tỷ lệ thấp nhất đó là nhóm ≥40 tuổi, theo chúng tôi, tỷ lệ này thấp vì đa số ở lứa tuổi này người vợ thường đã có thời gian xây dựng gia đình nhiều năm, có thể vô sinh nhưng đã được điều trị nhiều lần nhưng không có kết quả hoặc đã nản chí vì nhiều tuổi nên không đi xét nghiệm nữa. Còn ở người chồng nhóm tuổi 20-24 có tỷ lệ thấp, điều này phản ánh thực tế ở Việt Nam hiện nay ngày càng có ít nam giới lấy vợ trong độ tuổi này, nhất là ở khu vực thành thị. Ngoài ra, những nam giới lấy vợ độ tuổi này cũng có thể chưa muốn có con ngay và chưa phát hiện vô sinh nên chưa đi khám và làm xét nghiệm.
Như vậy, tuổi của các cặp vợ chồng vô sinh liên quan đến độ tuổi xây dựng gia đình. Tuổi tác ở người vợ có liên quan đến số lượng và chất lượng trứng, còn ở người chồng có liên quan đến số lượng và chất lượng tinh trùng. Các cặp vợ chồng vô sinh cần đi khám, xét nghiệm và được tư vấn di truyền càng sớm càng tốt để phát hiện nguyên nhân vô sinh cũng như quyết định hướng điều trị thích hợp.
3.2. Nghề nghiệp của các cặp vợ chồng vô sinh nguyên phát
Nghiên cứu của chúng tôi được thực hiện tại phòng xét nghiệm Bộ môn Y sinh học – Di truyền, Đại học Y Hà Nội, vì vậy các đối tượng chủ yếu là người khu vực Hà Nội và các tỉnh Miền Bắc gần Hà Nội.
Trong tổng số 187 cặp vợ chồng vô sinh nguyên phát đã được xét nghiệm, phân tich NST và lập karyotyp bao gồm: cán bộ viên chức (CBVC), công nhân, làm ruộng, bộ đội, lao động tự do..
Bảng 2. Sự phân bố về nghề nghiệp của các cặp vợ chồng vô sinh nguyên phát
Nghề nghiệp Vợ Chồng Số lượng (n) Tỷ lệ (%) Số lượng (n) Tỷ lệ (%) CBVC 90 48,13 63 33,69 Công nhân 36 19,25 56 29,94 Làm ruộng 29 15,51 23 12,30 Bộ đội 2 1,07 12 6,42 Tự do 30 16,04 33 17,65 Tổng 187 100 187 100 Nhận xét:
Nghề nghiệp của các cặp vợ chồng vô sinh là CNVC chiếm tỷ lệ cao cả ở người vợ và người chồng, người vợ có 90 trường hợp (48,13%), người chồng có 63 trường hợp (33,69%)
Nhóm chiểm tỷ lệ thấp nhất ở cả người vợ và người chồng là nghề bộ đội, người vợ có 2 trường hợp (1,07%) và người chồng có 12 trường hợp (6,42%)
Như vậy, theo nghiên cứu của chúng tôi, các đối tượng đến xét nghiệm NST là cán bộ viên chức, làm nghề có tính chất văn phòng chiếm tỷ lệ cao nhất; sau đó đến nhóm công nhân lao động ở người vợ có 36 trường hợp (19,25%) và người chồng có 56 trường hợp (chiếm 29,94%). Điều này là do các đối tượng sống chủ yếu ở Hà Nội
và các tỉnh xung quanh do thuận tiện về thông tin, đi lại, tài chính… nên đi khám vô sinh và làm xét nghiệm. Ngoài ra các nhóm đối tượng khác chiếm tỷ lệ thấp hơn như: nhóm người làm nghề tự do, kinh doanh người vợ có 30 trường hơp (16,04%), người chồng có 33 trường hợp (17,65%), nhóm người làm ruộng người vợ có 29 trường hợp (15,51%), người chồng có 23 trường hợp (12,3%) và nhóm ít nhất là nhóm đối tượng bộ đội người vợ có 2 trường hợp (1,07%) và chồng có 12 trường hợp (6,42%).
Kết quả nghiên cứu phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Xuân Bái (2002) có 38,5% đối tượng xét nghiệm vô sinh nam là công chức, 23,2% là công nhân và lái xe,