2.2.1. Lập hồ sơ bệnh án di truyền
Những cặp vợ chồng có tiền sử sảy thai liên tiếp và sinh con bị dị tật bẩm sinh đã được thăm khám lâm sàng, khai thác về tiền sử gia đình, tiền sử bản thân bao gồm: tuổi, nghề nghiệp, các bệnh mãn tính (bệnh đái tháo đường, các bệnh về tuyến giáp…), các bệnh nhiễm trùng (viêm gan siêu vi trùng, các bệnh phụ khoa…), có tiếp xúc với các hóa chất độc, thuốc bảo vệ thực vật, có nghiện rượu, thuốc lá… và tiền sử về sản khoa….
2.2.2. Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào bạch cầu lympho máu ngoại vi để thu hoạch cụm kỳ giữa, phân tích nhiễm sắc thể và lập karyotype.
Nuôi cấy tế bào bạch cầu lympho máu ngoại vi theo phương pháp của Hungerford D.A. (1965) [39].
Lấy 2ml máu tĩnh mạch cho vào ống li tâm đã được tráng bằng heparin đậy nút cao su kín và vô trùng.
Các bước nuôi cấy phải được thực hiện trong buồng cấy tế bào trong điều kiện vô trùng.
Dùng ống hút nhỏ giọt pipet Pasteur cho từ 6 – 8 giọt máu toàn phần vào túyp nuôi cấy có chứa 6ml môi trường nuôi cấy F10 hoặc F12, 2ml huyết thanh bê và 0,1ml PHA ( phytohemagglutinin). Đậy nắp rồi để túyp nuôi cấy trong tủ ấm 37oC thời gian 72 giờ. Đến giờ thứ 70 bổ sung vào túyp nuôi cấy 1ml dung dịch Colcemid với nồng độ 1µg/1ml để tích lũy nhiều cụm kỳ giữa và thu hoạch tế bào ở giờ thứ 72.
Thu hoạch tế bào
- Túyp nuôi cấy được li tâm với tốc độ 800 – 1000 vòng/1 phút thời gian 10 phút. - Loại bỏ dịch phía trên giữ lại phần cặn lắng chứa các tế bào, 30ml dung dịch nhược trương KCl 0,075 M cho vào túyp nuôi cấy và để trong tủ ấm 37oC thời gian khoảng 45 phút để phá vỡ màng tế bào.
- Li tâm, loại bỏ phần dịch phía trên, giữ lại phần cặn chứa nhân tế bào và các cụm NST ở kỳ giữa.
- Làm sạch mẫu vật bằng cách trộn với dung dịch Carnoy (3 methanol : 1 acid acetic ) rồi li tâm loại bỏ dịch nổi ở phía trên (3 lần).
- Lần cuối cùng khi mẫu vật đã sạch, sau khi li tâm loại bỏ dịch ở phía trên, dùng ống hút nhỏ giọt pipet Pasteur hút lấy phần cặn chứa nhân tế bào và các cụm kỳ giữa và dàn tế bào đều lên lam kính sạch đã được để lạnh.
- Để tiêu bản khô tự nhiên rồi tiến hành nhuộm tiêu bản. Phương pháp nhuộm băng theo Seabright M (1971) [65].
- Nhuộm tiêu bản bằng phương pháp nhuộm băng G theo phương pháp của Seabright. M (1971).
Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất:
Dụng cụ: 5 cốc thủy tinh loại 100ml để đựng hóa chất và thuốc nhuộm, 2 cốc mỏ thủy tinh loại 500ml đựng nước rửa tiêu bản.
Hóa chất: NaCl 0,15N, Trypsin 1: 250 (Difco) KH2PO4, Na2HPO42H2O, Giemsa.
Cách pha hóa chất:
Dung dịch Trypsin mẹ 5%
Dung dịch Trypsin sử dụng: 1 ml dung dịch Trypsin mẹ 49 ml dung dịch NaCl 0,15N Dung dịch đệm photphat KH2PO4 : 3,56g/1 lít
Na2HPO42H2O: 7,22g/1 lít H2O Dung dịch Giemsa 4%: 2 ml dung dịch Giemsa mẹ
48 ml dung dịch đệm photphat pH 6,8
Các bước tiến hành được thực hiện trong điều kiện ở nhiệt độ phòng thí nghiệm:
Nhúng tiêu bản vào cốc đựng dung dịch NaCl 0,15N thời gian khoảng 25 – 30 giây.
Sau đó tiêu bản được cho vào một cốc khác đựng dung dịch Trypsin 0,1% (Difco 1: 250).
Rửa tiêu bản lặp lại 2 lần trong một cốc đựng dung dịch NaCl 0,15N.
Tiêu bản được nhuộm bằng thuốc nhuộm Giemsa 4% pH = 7, thời gian 10 phút.
Tất cả các tiêu bản sau khi nhuộm xong được rửa trong 2 cốc đựng nước máy hoặc dưới vời nước máy chảy nhẹ. Kiểm tra độ phân vùng dưới kính hiển vi, rồi sau đó để tiêu bản khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng thí nghiệm.
Phương pháp phân tích nhiễm sắc thể và lập karyotype: theo tiêu chuẩn ISCN (2005) [67].
Phân tích NST được thực hiện dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần. Mỗi cặp vợ chồng được phân tích NST:
- Với tiêu bản nhuộm băng G, chúng tôi phân tích 20 cụm kỳ giữa bao gồm: đếm số lượng NST, phát hiện những bất thường cấu trúc của NST. Trường hợp thể khảm có thể phân tích 100 cụm kỳ giữa.
- Tiêu chuẩn đánh giá: quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại x1000, tìm các cụm NST của tế bào đang phân chia ở kỳ giữa. Sau đó chọn các cụm có các NST trải đều trên một diện tích và tạo thành một đám tròn tương đối đều đặn, các NST không chồng chất lên nhau có thể phân biệt được từng chiếc và đếm chính xác số lượng NST của từng cụm. Cũng trong các cụm đó, quan sát kỹ từng chiếc NST, phát hiện những bất thường về cấu trúc.
Lập karyotype: Mỗi bệnh nhân được chọn 3 cụm kỳ giữa và lập karyotype trên phần mềm của vi tính theo tiêu chuẩn ISCN – 2005 (An International System for Human Cytogenetic Nomenclature) .
Tổng hợp các số liệu đã quan sát rồi kết luận về số lượng và cấu trúc của bộ NST.
Hình 4: Kính hiển vi