Khử lần 2 dùng NaOH:

Các thí nghiệm của mẫu khử protein bằng NaOH theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm:

Khử protein bằng xút loãng là phương pháp sử dụng xút ở nồng độ thấp để thủy phân các liên kết peptit của protein không hòa tan tạo thành các dạng peptit, pepton, acid amin hòa tan trong nước và dễ dàng loại bỏ ra khỏi nguyên liệu. Như trên đã nói protein

trong phế liệu tôm tồn tại dưới hai dạng là dạng tự do thường là phần thịt trong đầu, chân, đuôi tôm và phần protein liên kết với chitin và các thành phần khác vì vậy muốn loại bỏ protein ra khỏi nguyên liệu phải sử dụn g các tác nhân hóa học hoặc sinh học để thủy phân protein. Tuy nhiên, phương pháp sinh học không thể loại bỏ protein một cách triệt để được, do đó ta phải kết hợp cả 2 phương pháp sinh học và hóa học để đảm bảo hàm lượng protein còn lại trong Chitin là < 1%.

Phương trình phản ứng biểu diễn quá trình khử protein nh ư sau:

H₂N-CH-CO-NH-CH-CO- H₂N-CH-CO-NH-CH- + H₂N-CH-COOH

R1 R2 R1 R2 R3

Polypeptid Peptid Acid amin

Quá trình khử protein thường kèm theo quá trình khử lipid do lipid có thể phản ứng với kiềm tạo thành xà phòng theo ph ương trình phản ứng sau:

CH2OCOR1 CH2OH

CHOCOR2 + 3NaOH CHOH + R1COONa + R2COONa + R3COONa

CH2OCOR3 CH2OH

Triaxylglycerol Glycerol Xà phòng

Thông thường hàm lượng của lipid trong nguyên liệu không cao do vậy không cần nghiên cứu loại bỏ lipid trong công nghệ sản xuất chitin -chitosan vì phần nhỏ lipid đã bị thủy phân theo phản ứng trên.

Các yếu tố cố định: - Nhiệt độ : 40^oC

- Tỷ lệ mẫu đem đi xử lý NaOH/dung dịch NaOH là: 1/10(w/v)

NaOH

Các thông số cần tối ưu là:

- Nồng độ NaOH trong khoảng: [0,1%-0,3%] - Thời gian xử lí NaOH trong khoảng: [8h-10h]

Hàm mục tiêu là: Hàm lượng protein còn lại trong mẫu sau khi thủy phân (Y) (% theo vật chất khô) → Min.

Bảng 7.Bố trí thí nghiệm theo qui hoạch thực nghiệm với biến ảo của công đoạn khử protein bằng NaOH

N U1(Nồng độ NaOH(%)) U2 (Thời gian (h)) X0 X1 X2 Y(%) 1 0,1 8 1 -1 -1 2 0,3 8 1 1 -1 3 0,1 10 1 -1 1 4 0,3 10 1 1 1

Bảng 8. Bố trí thí nghiệm ở tâm phương án của công đoạn khử protein bằng NaOH.

STT U1 U2 Y(%)

5 0,2 11

6 0,2 11

7 0,2 11

U1 : Nồng độ NaOH(%) U2: Thời gian xử lí NaOH(giờ)

2.3.4.3.Thí nghiệm xác định chế độ khử khoáng a. Khử lần 1: Dùng acid benzoic

Các thí nghiệm của mẫu khử khoáng bằng acid benzoic theo ph ương pháp quy hoạch thực nghiệm

Mục đích của công đoạn này là nghiên cứu khả n ăng khử khoáng của axít benzoic trên nguyên li ệu là đầu tôm đã được khử protein bằng enzym Alcalaza và NaOH ở điều kiện tối ưu.

Công đoạn khử khoáng được thực hiện bằng cách ngâm phế liệu tôm trong dung dịch acid benzoic. Các thông số tối ưu được xác định bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm và các tính toán được thực hiện trên phần mềm MS.Excel 2003.

Theo phương pháp quy ho ạch thực nghiệm (được trình bày ở phần phụ lục) đã xác định được các thông số tối ưu cho công đoạn khử khoáng như sau:

Các yếu tố cố định:

- Nhiệt độ : nhiệt độ phòng

- Tỷ lệ mẫu đem đi khử khoáng/dung dịch acid benzoic =1/15 (w/v) Các thông số cần tối ưu là:

- Nồng độC₆H₅COOH trong khoảng: [0,012M- 0,018M] - Thời gian xử lí C₆H₅COOH trong khoảng: [4h-10h]

Hàm mục tiêu là: Hàm lượng khoáng còn lại trong mẫu sau khi khử khoáng (Y) (% theo vật chất khô) → Min.

Bảng 9. Bố trí thí nghiệm theo qui hoạch thực nghiệm v ới biến ảo của công đoạn khử khoáng bằng C₆H₅COOH

N ^{U1 (nồng độ}

C₆H₅COOH (M)) ^{U2 (thời gian (h)) X0 X1 X2 Y(%)}

1 0,012 4 1 -1 -1

2 0,018 4 1 1 -1

3 0,012 10 1 -1 1

4 0,018 10 1 1 1

Bảng 10. Bố trí thí nghiệm ở tâm phương án của công đoạn khử khoáng bằng C₆H₅COOH

STT U1 U2 Y(%)

5 0,015 7

6 0,015 7

U1 : Nồng độ C₆H₅COOH(M)

U2: Thời gian xử lí ngâm C₆H₅COOH (giờ)

b. Khử lần 2: Dùng acid chlohydric

Các thí nghiệm của mẫu khử khoáng bằng HCl theo ph ương pháp quy hoạch thực nghiệm:

Sau khi khử protein bằng enzyme và NaOH thì % hàm l ượng khoáng còn lại rất lớn, dùng acid benzoic không thể loại bỏ khoáng một cách triệt để được, do đó ta phải kết hợp sử dụng cả acid hữ cơ kết hợp acid vô cơ để đảm bảo hàm lượng khoáng còn lại trong Chitin là < 1%.

Mục đích của công đoạn này là nghiên cứu khả n ăng khử khoáng của axít chlohydric trên nguyên li ệu là đầu tôm đã được khử protein bằng enzym Alcalaza và NaOH và đã khử khoáng một phần bằng acid benzoic ở điều kiện tối ưu.

Công đoạn khử khoáng được thực hiện bằng cách ngâm phế liệu tôm trong dung dịch HCl. Các thông số tối ưu được xác định bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm và các tính toán được thực hiện trên phần mềm MS.Excel 2003. Theo phương pháp quy ho ạch thực nghiệm (được trình bày ở phần phụ lục) đã xác định được các thông số tối ưu cho công đoạn khử khoáng như sau:

Các yếu tố cố định:

- Nhiệt độ : nhiệt độ phòng

- Tỷ lệ mẫu đem đi khử khoáng/dung dịch HCl =1/10 (w/v) Các thông số cần tối ưu là:

- Nồng độHCl trong khoảng: [0,6M- 0,8M] - Thời gian xử lí HCltrong khoảng: [4h-10h]

Hàm mục tiêu là: Hàm lượng khoáng còn lại trong mẫu sau khi khử khoáng (Y) (% theo vật chất khô) → Min.

Bảng 11. Bố trí thí nghiệm theo qui hoạch thực nghiệm với biến ảo của công đoạn khử khoáng bằng HCl. N U1(Nồng độ HCl(M)) U2 (Thời gian (h)) X0 X1 X2 Y(%) 1 0,6 4 1 -1 -1 2 0,8 4 1 1 -1 3 0,6 10 1 -1 1 4 0,8 10 1 1 1

Bảng 12. Bố trí thí nghiệm ở tâm phương án của công đoạn khử khoáng bằng HCl

STT U1 U2 Y(%)

5 0,7 7

6 0,7 7

7 0,7 7

U1 : Nồng độ HCl (M)

U2: Thời gian xử lí ngâm HCl (giờ)

2.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HÓA H ỌC:[1]

2.3.1. Xác định hàm lượng ẩm bằng phương pháp sấy ở nhiệt độ 105^oC theoTCVN 3700-1990. TCVN 3700-1990.

2.3.2. Xác định hàm lượng khoáng bằng phương pháp nung ở 600^oC.2.3.3. Xác định hàm lượng protein theo ph ương pháp Microbiuret: 2.3.3. Xác định hàm lượng protein theo ph ương pháp Microbiuret:

Nguyên lý: Trong môi trường kiềm, protein kết hợp với Cu⁺⁺ thành một phức chất màu tím (phản ứng biuret). Màu sắc của phức chất t ỷ lệ với số liệu peptid (-CO-NH) của protein và gần như không phụ thuộc vào nồng độ tương đối giữa albumin và globulin.

Hình 15.Công thức của phức Biuret.

2.3.3.1. Dụng cụ

-Dụng cụ thủy tinh(ống nghiệm, cốc thủy tinh, ống đong, bình định mức, bình tam giác, pipette), v ật liệu thông thường của phòng thí nghiệm

- Micropipet (100-1000μl) -Thiết bị đo UV-Vis mini1240

2.3.3.2. Hóa chất- NaOH - NaOH - Na₂CO₃ (Sodium Cabonate) - CuSO₄.5H₂O - Na₃C₆H₅O₇.2H₂O (Sodium citrate) 2.3.3.3. Tiến hành

● Pha dung dịch thuốc thử Microbiuret :

Lấy 173g Sodium citrate và 100g Sodium carbonate, đem hòa tan trong nước nóng nhưng không để nước sôi.

Lấy 17,3g CuSO₄ hòa tan trong 100ml n ước cất và thêm vào hỗn hợp trên. Sau đó thêm nước cất vào cho đủ 1 lít.

● Xây dựng đường chuẩn:được bố trí như đã nói ở phần bố trí thí nghiệm ● Xử lý mẫu:

Lấy 1g mẫu + 20ml NaOH 3% →ủ ở 80^oC,trong 6 giờ. Sau đó, hỗn hợp này được làm lạnh ở nhiệt độ phòng, rồi sau đó mang đi lọc. Khi lọc, dùng từ 10 -15ml NaOH 3% để rửa bã.

Sau đó đem dịch đi li tâm ở 5000 vòng/15 phút → Lấy dịch → Pha loãng sao cho hàm lương protein n ằm trong dãi bước sóng.

Lấy 4ml + 200μl Microbiuret → đo ở bước sóng 330nm.

Kết quả đo được tương ứng với giá trị y (OD330nm), dựa vào phương trình đường chuẩn tính ra được hàm lượng protein có trong 1 ml dịch. Từ đó tính ra được phần trăm protein có trong mẫu theo công thức tính sau:

100 / ) 100 .( 1000 . 100 . . % Mc m C V protein  

V: Thể tích mẫu sau khi pha loãng(ml) C: Hàm lượng protein trong 1 ml(mg/ml) m: Khối lượng mẫu đem đi ủ (gam) Mc: Độ ẩm của mẫu đem đi phân tích (%)

2.3.4. Xác định hàm lượng Protein theo ph ương pháp Biuret:2.3.4.1. Dụng cụ:giống như phương pháp Microbiuret. 2.3.4.1. Dụng cụ:giống như phương pháp Microbiuret.

2.3.4.2. Hóa chất:

NaOH CuSO₄.5H₂O

C₄H₄NaKO₆.4H₂O (Kali Natri tartrat) BSA (Bovine serum albumin)

2.3.4.3. Tiến hành:

Pha thuốc thử Biuret: Hòa tan 2,35375 gam CuSO₄.5H₂O và 8,0571 gam C₄H₄NaKO₆.4H₂O trong 500ml nước cất, khuấy đều và cho thêm 300ml NaOH 10%. Dung dịch trên được khuấy trộn đều rồi làm đầy đến 1000ml bằng nước cất .

Xây dựng đường chuẩn: được bố trí như đã nói ở phần bố trí thí nghiệm.

Cách 1: Ngâm 3-5gam nguyên liệu khô hoặc 3-10 gam nguyên liệu ướt trong NaOH 4% với tỷ lệ 1:10 tới 1:15w/v. Sau đó đem ủ ở 95^oC trong 6 giờ.

Cách 2: Xử lí mẫu giống như trên nhưng không ủ ở 95^oC trong 6 giờ mà ủ ở nhiệt độ phòng 12 giờ, sau đó nâng nhiệt lên 95^oC trong 1 giờ.

Sau khi ủ: Đối với dịch thủy phân thu được, nếu không đủ 100ml thì thêm nước cất vào cho đủ 100ml. Lấy khoảng 10ml dịch thủy phân đem đi lọc chân không bằng giấy lọc Whatman Filter paper.

Phần dịch lọc được đem đi phân tích hàm lư ợng protein bằng thiết bị đo UV- Vis mini1240.

2.3.5. Phương pháp xử lý số liệu: Các số liệu được xử lý theo phần mềm Excel2003. Mỗi thí nghiệm bố trí song song 3 thí nghiệm, mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần, 2003. Mỗi thí nghiệm bố trí song song 3 thí nghiệm, mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần, lấy kết quả trung bình cộng 3 lần thí nghiệm.

PHẦN 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả đường chuẩn xây dựng được theo phương pháp Microbiuret vàphương pháp Biuret: phương pháp Biuret:

3.1.1. Kết quả xây dựng đường chuẩn của phương pháp Microbiuret :Kết quả đo được (ở phụ lục) Kết quả đo được (ở phụ lục)

Phương trình đường chuẩn.

Đồ thị đường chuẩn BSA

y = 1.4689x + 0.0027 R² = 0.9998 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 Hàm lượng protein(mg/ml) O D 33 0n m

Hình 16. Phương trình đường chuẩn của phương pháp Microbiuret 3.1.2. Kết quả xây dựng đường chuẩn của phương pháp Biuret:

Đồ thị đường chuẩn BSA

Hình 17. Phương trình đường chuẩn của phương pháp Biuret. 3.2. Thành phần hóa học của phế liệu tôm thẻ :

Kết quả phân tích thành phần hóa học của phế liệu tôm thẻ chân t rắng được trình bày tại bảng 3.1.

Bảng 13. Thành phần hóa học của phế liệu tôm thẻ chân trắng (%)

Chỉ tiêu Protein Lipid Tro Chitin

Thành phần

hóa học (%) ^{49 4,7 25,2 18,3}

(Tính theo vật chất khô)

Kết quả phân tích cho thấy tôm th ẻ chân trắng (Penaeus vannamei) có hàm lượng protein trong phế liệu tôm khá cao. Kết quả này cho thấy cần sử dụng phương pháp sinh học để thủy phân protein để tận dụng lượng protein có chất lượng vào việc chế biến thức ăn gia súc,… đồng thời nghiên cứu hoà n thiện quy trình sản xuất chitin vừa có hiệu quả kinh tế, vừa mang ý nghĩa môi tr ường.Hàm lượng khoáng trong đầu tôm cũng khá cao, hàm l ượng lipid và hàm lượng Chitin được tham khảo.[13]

3.3. Kết quả nghiên cứu công đoạn khử protein bằng enzyme Alcalase:

Công đoạn khử protein này được thực hiện bằng cách bổ sung enzyme Alcalase để thủy phân phế liệu tôm. Các thông số tối ưu được xác định bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm và các tính toán được thực hiện trên phần mềm MS.Excel 2003.

Theo phương pháp quy ho ạch thực nghiệm (được trình bày ở phần phụ lục) đã xác định được các thông số tối ưu cho công đoạn khử protein như sau:

Bảng 14. Kết quả hàm lượng protein còn lại ở các chế độ khử protein bằng enzyme Alcalase

N U1(nồng độ %) U2(nhiệt độ) U3(thời gian) X0 X1 X2 X3 ^{Y(%) lượng} protein còn lại 1 0,1 40 4 1 -1 -1 -1 19,6183 2 0,5 40 4 1 1 -1 -1 11,8941 3 0,1 60 4 1 -1 1 -1 13,023 4 0,5 60 4 1 1 1 -1 14,233 5 0,1 40 10 1 -1 -1 1 11,5383 6 0,5 40 10 1 1 -1 1 10,5916 7 0,1 60 10 1 -1 1 1 9,9975 8 0,5 60 10 1 1 1 1 9,3423

Bảng 15. Thí nghiệm ở tâm ph ương án của công đoạn khử protein bằng enzyme Alcalase

N0 U1 U2 U3 Y(%)

9 0,3 50 7 12,67

10 0,3 50 7 12,7970

11 0,3 50 7 13,8167

Phương trình hồi quy của hàm lượng protein xác định được như sau:

Thảo luận: Phương trình (1) tương thích với thực nghiệm :qúa trình thủy phân để khử protein của phế liệu tôm bằng enzyme phụ thuộc vào nhiều yếu tố nh ư: nồng độ enzyme, nhiệt độ, thời gian …Qua phương trình trên ta thấy quy luật biến đổi của hàm lượng protein là khi t ăng nồng độ enzyme (X1), nhiệt độ thủy phân (X2) và thời gian khử protein (X3) thì hàm l ượng protein còn lại trong phế liệu tôm (Y) giảm xuống, nhưng thời gian thủy phân và nồng độ enzyme ảnh hưởng tới hàm lượng protein nhiều hơn so với nhiệt độ thủy phân. Từ phương trình (1) nếu muốn khử protein một cách triệt để ta phải tăng nồng độ enzyme, thời gian khử protein và nhiệt độ thủy phân; song việc t ăng cao nồng độ enzyme, nhiệt độ thủy phân và kéo dài thời gian khử protein nh ư thế nào cho hợp lí để tiết kiệm được thời gian và chi phí sản xuất mà vẫn đảm bảo được lượng protein còn lại trong phế liệu tôm là ít nhất. Như vậy xuất phát từ mức c ơ sở, tiến hành làm thí nghiệm tối ưu theo đường dốc nhất và thu được kết quả các thí nghiệm tiếp theo ở b ảng 16

Bảng 16. Kết quả hàm lượng protein các thí nghiệm tối ưu theo đường dốc nhất

Bảng kết quả thí nghiệm tối ưu hóa

Tên U1(nồng độ %) U2(nhiệt độ) U3(thời gian) Y(%)

Mức cơ sở 0,3 50 7 Bước làm tròn 0,04 2 0,6 Thí nghiệm 12 0,34 52 7,6 9,451 Thí nghiệm 13 0,38 54 8,2 9,2528 Thí nghiệm 14 0,42 56 8,8 8,0102 Thí nghiệm 15 0,46 58 9,4 8,655

Từ bảng thí nghiệm trên ta nhận thấ y ở thí nghiệm thứ 14 hàm l ượng protein còn lại trong phế liệu tôm là thấp nhất.

9.451 9.2528 8.0102 8.655 7 7.5 8 8.5 9 9.5 10 12 13 14 15 Thí nghiệm H à m l ư ợ n g p ro te in c ò n l ạ i( % )

Hình 18. Kết quả nghiên cứu tối ưu hóa chế độ thủy phân bằng enzyme theo phương pháp đường “lên dốc” của BoxWillson.

Nhận xét và thảo luận: Bố trí thí nghiệm theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm toán học cho phép dần tới điểm tối ưu nhất. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa toán học cao với độ tin cậy là 95%. Điểm tối ưu đạt được ở thí nghiệm thứ 14 với nồng độ enzyme là 0,42%, ở nhiệt độ 56^oC và ứng với thời gian tương ứng là 8,8 giờ.

3.4. Kết quả nghiên cứu công đoạn khử protein bằng NaOH:

Công đoạn khử protein được thực hiện bằng cách ngâm phế liệu tôm trong dung dịch acid NaOH loãng. Các thông số tối ưu được xác định bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm và các tính toán được thực hiện trên phần mềm MS.Excel 2003.

Theo phương pháp quy ho ạch thực nghiệm (được trình bày ở phần phụ lục) đã xác định được các thông số tối ưu cho công đoạn khử protein như sau.

Bảng 17. Kết quả hàm lượng protein ở các chế độ khử protein bằng NaOH

N U1 (nồng độ %) U2 (thời gian) X0 X1 X2 ^{Y (%) lượng} protein còn lại

1 1 8 1 -1 -1 1,78

2 3 8 1 1 -1 1,04

3 1 14 1 -1 1 1,34

Bảng 18. Thí nghiệm ở tâm phương án của công đoạn khử protein bằng NaOH

N0 U1 U2 Y(%)

9 2 11 1,1214

10 2 11 1,0764

11 2 11 1,1319

Phương trình hồi quy của hàm lượng protein xác định được như sau :

Y= 1,245 – 0,315*X1 – 0,165*X2 (2)

Thảo luận: Phương trình (2) tương thích với thực nghiệm và qua phương trình trên ta thấy quy luật biến đổi của hàm lượng protein là khi tăng nồng độ dung dịch NaOH (X1) và thời gian khử protein (X2) thì hàm l ượng protein trong phế liệu tôm (Y) giảm xuống, nhưng nồng độ NaOH ảnh hưởng tới hàm lượng protein nhiều