NaOH tinh thể dạng phân tích. HCl dạng phân tích
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU 2.2.1. Phương pháp thu nhận mẫu
Nguyên liệu đầu tôm được thu tại phân xưởng chế biến, Công ty Cổ phần Nha Trang Seafoods (F17). Yêu c ầu NL phải tươi, không có mùi lạ, không bị biến đỏ, không lẫn tạp chất. NL sau khi lấy cho n gay vào thùng xốp cách nhiệt có chứa nước đá và vận chuyển ngay về phòng thí nghiệm. NL được rửa sạch và xay nhuyễn (trong đó có 100% là đ ầu tôm , tất cả các mẫu thí nghiệm đều được xay bởi cùng một thiết bị và kích thước mẫu sau khi xay là 0,5 ÷ 0, 8 cm) và tiến hành làm thí nghiệm ngay. Trong trường hợp chưa làm ngay thì rửa sạch, cân cho vào túi polyme ( mỗi túi 1 kg), bảo quản đông ở điều kiện nhiệt độ -20oC.
2.2.2. Bố trí thí nghiệm xác định các thông số kỹ thuật
Phương pháp bố trí thí nghiệm: dùng ph ương pháp qui hoạch thực nghiệm Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Mô tả quy trình
Nguyên liệu vỏ đầu tôm được xay nhỏ và khử protein bằng enzyme protease (Alcalase) trong môi trư ờng có pH và tỷ lệ E/S theo tỷ lệ nghiên cứu. Tiến hành thuỷ phân protein để chọn ra thời gian, tỷ lệ E/S, nhiệt độ thích hợp. Sau khi tìm được chế độ tối ưu ta tiến hành thuỷ phân rồi lọc tách riêng phần dịch và phần bã. Phần dịch tận dụng thu protein và asthaxanthin dùng để sản xuất thức ăn chăn nuôi. Phần bã được rửa sạch, phơi khô, tiếp tục khử protein bằng NaOH, khử khoáng bằng C6H5COOH và HCl, ở mỗi công đoạn cũng tiến hành thực hiện để chọn được chế độ tối ưu (nồng độ, thời gian xử lý) sau đó rửa sạch và thu được Chitin.
Quy trình dự kiến sản xuất chitin từ phế liệu tôm:
Hình 13.Quy trình dự kiến sản xuất.
Sau khi tìm được các thông số tối ưu của các công đoạn, ta tiến hành sản xuất Chitin theo các thông số tối ưu của công đoạn khử protein bằng enzyme và NaOH, còn ở công đoạn khử khoáng ta chỉ dùng HCl, không dùng C6H5COOH.
Theo Nguyễn Văn Toàn và cộng sự đã nghiên cứu [22], công đoạn khử khoáng chỉ dùng HCl 1,1M; ngâm trong 12 giờ ở 30oC được áp dụng đối với phế liệu đầu vỏ tôm, kết quả hàm l ượng khoáng còn lại trong Chitin là 1, 11±0,01%. Ở
Xay nhỏ
Tách protein bằng enzyme Alcalase
Dịch protein Tỉ lệ E/NL:[0,1-0,5%] Nhiệt độ: [40-60oC] Thời gian:[4-10h] Khử protein bằng NaOH CM= 0,012÷0,018M Thời gian: 4÷10h Nhiệt độ phòng Rửa Rửa Chitin
Khử khoáng bằng acid benzoic
Khử khoáng bằng HCl Đầu tôm CM = 1÷3% Thời gian: 8÷10h Nhiệt độ phòng CM=0,6÷0,8M Thời gian: 4÷10h Nhiệt độphòng
đây đối tượng nguyên liệu được nghiên cứu là phế liệu đầu tôm, đầu tôm thường thì hàm lượng khoáng cao hơn cho nên em đã dự kiến quy trình đối chứng với nồng độ HCl là 1,2M; và ngâm trong 16 gi ờ ở nhiệt độ phòng. Quy trình dự kiến sản xuất đối chứng như sau:
Hình 14.Quy trình sản xuất Chitin không dùng acid benzoic.( đối chứng)
2.2.2.1. Bố trí thí nghiệm xây dựng đường chuẩn của phương phápMicrobiuret và phương pháp Biuret Microbiuret và phương pháp Biuret
●Xây dựng đường chuẩn cho phương pháp Microbiuret:
Hòa tan 0.1 gam huyết thanh bò (BSA) trong NaOH 3% tạo thành các nồng độ khác nhau sao cho nồng độ protein trong dịch thuộc khoảng từ 0.05 -0.5g/l.
Xay nhỏ Tách protein bằng enzyme Alcalase Bã đã tách protein Dịch protein Tỉ lệ E/NL:0,42% Nhiệt độ: 56oC Thời gian:8,8 giờ
Khử protein bằng NaOH
Nồng độ:2,4% Thời gian:12,2 giờ. Nhiệt độ phòng
Khử khoáng bằng HCl
Chitin
Nồng độ:1,2M Thời gian:16 giờ Nhiệt độ phòng Đầu tôm
Chuẩn bị 7 ống nghiệm sạch, đánh số thứ tự từ 1 đến 7, sau đó cho các dung dịch hóa chất vào các ống nghiệm với thể tích và thứ tự nh ư sau:
Bảng 3.Bố trí thí nghiệm chạy đường chuẩn của phương pháp Microbiuret
Ống nghiệm Nồng độ Số ml dịch BSA(ml) Số ml NaOH 3%(ml)
1 0 0 4 2 0,05 0,2 3,8 3 0,1 0,4 3,6 4 0,2 0,8 3,2 5 0,3 1,2 2,8 6 0,4 1,6 2,4 7 0,5 2 2 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sau đó lấy mỗi mẫu 4ml, thêm vào đó 200μl thuốc thử Microbiuret,vortex cho đều và ủ sau 15 phút mang đi đo ở bước sóng 330nm. (Sử dụng ống 0 làm mẫu blank).
●Xây dựng đường chuẩn cho phương pháp Biuret:
Pha dung dịch chuẩn BSA: Hòa tan 0,5 gam BSA vào trong 50ml n ước cất, khuấy dần dần khi BSA tan hết rồi định mức lên 100ml bằng n ước cất (Hàm lượng BSA: 10mg/ml).
Xây dựng đường chuẩn:Chuẩn bị 6 ống nghiệm sạch, đánh số thứ tự từ 0-5 sau đó cho các dung dịch hóa chất vào các ống nghiệm với thể tích và thứ tự nh ư sau:
Bảng 4. Bố trí thí nghiệm chạy đường chuẩn của phương pháp Biuret
Ống nghiệm Dung dịch hóa chất 0 1 2 3 4 5 BSA chuẩn (ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Nước cất (ml) 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Thuốc thử Biuret (ml) 4 4 4 4 4 4 Hàm lượng BSA(mg/ml) 0 2 4 6 8 10
Sau khi đã cho đầy đủ các hóa chất, ủ các ống nghiệm trên ở nhiệt độ phòng trong thời gian 30 phút.
Sau khi ủ, dung dịch trong các ống nghiệm trên được đo mật độ quang học ở bước sóng 570nm để đọc giá trị OD570 (Sử dụng ống 0 làm mẫu blank)
2.2.2.2. Bố trí thí nghiệm xác định thành phần hóa học của phế liệu đầu tômthẻ chân trắng thẻ chân trắng
–Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Biuret.
–Xác định hàm lượng khoáng bằng phương pháp nung ở 600oC
2.2.2.3. Thí nghiệm xác định chế độ khử protein tối ưua. Khử lần 1: dùng enzyme alcalase a. Khử lần 1: dùng enzyme alcalase
Thí nghiệm được bố trí theo phương pháp quy ho ạch thực nghiệm [8][9]
Mục đích của quá trình tối ưu là chọn một chế độ công nghệ thích hợp cho quá trình loại bỏ protein từ đầu tôm bằng enzyme Alcalase sao cho hàm lượng protein khử được là tốt nhất.
Phân tích ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình thủy phân, qua các thí nghiệm thăm dò và kế thừa kết quả nghiên cứu tr ước đây, đề tài chọn các yếu tố cố định như sau:
- pH = 8
- Tỷ lệ nguyên liệu / nước là 1:1
- Còn lại 3 thông số: tỷ lệ enzyme bổ sung, nhiệt độ và thời gian thủy phân ảnh hưởng đến hiệu suất khử protein. Đề tài nghiên cứu quy hoạch thực nghiệm phân tích hồi quy 3 yếu tố, sau đó tối ưu hóa quá trình bằng phương pháp đường dốc nhất để tìm giá trị tối ưu.
Các thông số cần tối ưu là:
- Nồng độ enzyme trong khoảng: [0,1%-0,5%] - Nhiệt độ thủy phân trong khoảng: [40oC-60oC] - Thời gian thủy phân trong khoảng: [4h-10h]
Hàm mục tiêu là: Hàm lượng protein còn lại trong mẫu sau khi thủy phân (Y) (% theo vật chất khô) → Min.
Bảng 5.Bố trí thí nghiệm theo qui hoạch thực nghiệm với biến ảo của công đoạn khử protein bằng enzyme Alcalase.
N U1(nồng độ %) U2(nhiệt độ) U3(thời gian) X0 X1 X2 X3 Y(%)
1 0,1 40 4 1 -1 -1 -1 2 0,5 40 4 1 1 -1 -1 3 0,1 60 4 1 -1 1 -1 4 0,5 60 4 1 1 1 -1 5 0,1 40 10 1 -1 -1 1 6 0,5 40 10 1 1 -1 1 7 0,1 60 10 1 -1 1 1 8 0,5 60 10 1 1 1 1
Bảng 6.Bố trí thí nghiệm ở tâm ph ương án của công đoạn khử protein bằng enzyme Alcalase STT U1 U2 U3 Y(%) 9 0,3 50 7 10 0,3 50 7 11 0,3 50 7 U1: nồng độ enzyme (%) U2: nhiệt độ thủy phân (oC) U3: thời gian thủy phân (giờ)
b. Khử lần 2 dùng NaOH:
Các thí nghiệm của mẫu khử protein bằng NaOH theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm:
Khử protein bằng xút loãng là phương pháp sử dụng xút ở nồng độ thấp để thủy phân các liên kết peptit của protein không hòa tan tạo thành các dạng peptit, pepton, acid amin hòa tan trong nước và dễ dàng loại bỏ ra khỏi nguyên liệu. Như trên đã nói protein
trong phế liệu tôm tồn tại dưới hai dạng là dạng tự do thường là phần thịt trong đầu, chân, đuôi tôm và phần protein liên kết với chitin và các thành phần khác vì vậy muốn loại bỏ protein ra khỏi nguyên liệu phải sử dụn g các tác nhân hóa học hoặc sinh học để thủy phân protein. Tuy nhiên, phương pháp sinh học không thể loại bỏ protein một cách triệt để được, do đó ta phải kết hợp cả 2 phương pháp sinh học và hóa học để đảm bảo hàm lượng protein còn lại trong Chitin là < 1%.
Phương trình phản ứng biểu diễn quá trình khử protein nh ư sau: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
H2N-CH-CO-NH-CH-CO- H2N-CH-CO-NH-CH- + H2N-CH-COOH
R1 R2 R1 R2 R3
Polypeptid Peptid Acid amin
Quá trình khử protein thường kèm theo quá trình khử lipid do lipid có thể phản ứng với kiềm tạo thành xà phòng theo ph ương trình phản ứng sau:
CH2OCOR1 CH2OH
CHOCOR2 + 3NaOH CHOH + R1COONa + R2COONa + R3COONa
CH2OCOR3 CH2OH
Triaxylglycerol Glycerol Xà phòng
Thông thường hàm lượng của lipid trong nguyên liệu không cao do vậy không cần nghiên cứu loại bỏ lipid trong công nghệ sản xuất chitin -chitosan vì phần nhỏ lipid đã bị thủy phân theo phản ứng trên.
Các yếu tố cố định: - Nhiệt độ : 40oC
- Tỷ lệ mẫu đem đi xử lý NaOH/dung dịch NaOH là: 1/10(w/v)
NaOH
Các thông số cần tối ưu là:
- Nồng độ NaOH trong khoảng: [0,1%-0,3%] - Thời gian xử lí NaOH trong khoảng: [8h-10h]
Hàm mục tiêu là: Hàm lượng protein còn lại trong mẫu sau khi thủy phân (Y) (% theo vật chất khô) → Min.
Bảng 7.Bố trí thí nghiệm theo qui hoạch thực nghiệm với biến ảo của công đoạn khử protein bằng NaOH
N U1(Nồng độ NaOH(%)) U2 (Thời gian (h)) X0 X1 X2 Y(%) 1 0,1 8 1 -1 -1 2 0,3 8 1 1 -1 3 0,1 10 1 -1 1 4 0,3 10 1 1 1
Bảng 8. Bố trí thí nghiệm ở tâm phương án của công đoạn khử protein bằng NaOH.
STT U1 U2 Y(%)
5 0,2 11
6 0,2 11
7 0,2 11
U1 : Nồng độ NaOH(%) U2: Thời gian xử lí NaOH(giờ)
2.3.4.3.Thí nghiệm xác định chế độ khử khoáng a. Khử lần 1: Dùng acid benzoic
Các thí nghiệm của mẫu khử khoáng bằng acid benzoic theo ph ương pháp quy hoạch thực nghiệm
Mục đích của công đoạn này là nghiên cứu khả n ăng khử khoáng của axít benzoic trên nguyên li ệu là đầu tôm đã được khử protein bằng enzym Alcalaza và NaOH ở điều kiện tối ưu.
Công đoạn khử khoáng được thực hiện bằng cách ngâm phế liệu tôm trong dung dịch acid benzoic. Các thông số tối ưu được xác định bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm và các tính toán được thực hiện trên phần mềm MS.Excel 2003.
Theo phương pháp quy ho ạch thực nghiệm (được trình bày ở phần phụ lục) đã xác định được các thông số tối ưu cho công đoạn khử khoáng như sau:
Các yếu tố cố định:
- Nhiệt độ : nhiệt độ phòng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Tỷ lệ mẫu đem đi khử khoáng/dung dịch acid benzoic =1/15 (w/v) Các thông số cần tối ưu là:
- Nồng độC6H5COOH trong khoảng: [0,012M- 0,018M] - Thời gian xử lí C6H5COOH trong khoảng: [4h-10h]
Hàm mục tiêu là: Hàm lượng khoáng còn lại trong mẫu sau khi khử khoáng (Y) (% theo vật chất khô) → Min.
Bảng 9. Bố trí thí nghiệm theo qui hoạch thực nghiệm v ới biến ảo của công đoạn khử khoáng bằng C6H5COOH
N U1 (nồng độ
C6H5COOH (M)) U2 (thời gian (h)) X0 X1 X2 Y(%)
1 0,012 4 1 -1 -1
2 0,018 4 1 1 -1
3 0,012 10 1 -1 1
4 0,018 10 1 1 1
Bảng 10. Bố trí thí nghiệm ở tâm phương án của công đoạn khử khoáng bằng C6H5COOH
STT U1 U2 Y(%)
5 0,015 7
6 0,015 7
U1 : Nồng độ C6H5COOH(M)
U2: Thời gian xử lí ngâm C6H5COOH (giờ)
b. Khử lần 2: Dùng acid chlohydric
Các thí nghiệm của mẫu khử khoáng bằng HCl theo ph ương pháp quy hoạch thực nghiệm:
Sau khi khử protein bằng enzyme và NaOH thì % hàm l ượng khoáng còn lại rất lớn, dùng acid benzoic không thể loại bỏ khoáng một cách triệt để được, do đó ta phải kết hợp sử dụng cả acid hữ cơ kết hợp acid vô cơ để đảm bảo hàm lượng khoáng còn lại trong Chitin là < 1%.
Mục đích của công đoạn này là nghiên cứu khả n ăng khử khoáng của axít chlohydric trên nguyên li ệu là đầu tôm đã được khử protein bằng enzym Alcalaza và NaOH và đã khử khoáng một phần bằng acid benzoic ở điều kiện tối ưu.
Công đoạn khử khoáng được thực hiện bằng cách ngâm phế liệu tôm trong dung dịch HCl. Các thông số tối ưu được xác định bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm và các tính toán được thực hiện trên phần mềm MS.Excel 2003. Theo phương pháp quy ho ạch thực nghiệm (được trình bày ở phần phụ lục) đã xác định được các thông số tối ưu cho công đoạn khử khoáng như sau:
Các yếu tố cố định:
- Nhiệt độ : nhiệt độ phòng
- Tỷ lệ mẫu đem đi khử khoáng/dung dịch HCl =1/10 (w/v) Các thông số cần tối ưu là:
- Nồng độHCl trong khoảng: [0,6M- 0,8M] - Thời gian xử lí HCltrong khoảng: [4h-10h]
Hàm mục tiêu là: Hàm lượng khoáng còn lại trong mẫu sau khi khử khoáng (Y) (% theo vật chất khô) → Min.
Bảng 11. Bố trí thí nghiệm theo qui hoạch thực nghiệm với biến ảo của công đoạn khử khoáng bằng HCl. N U1(Nồng độ HCl(M)) U2 (Thời gian (h)) X0 X1 X2 Y(%) 1 0,6 4 1 -1 -1 2 0,8 4 1 1 -1 3 0,6 10 1 -1 1 4 0,8 10 1 1 1
Bảng 12. Bố trí thí nghiệm ở tâm phương án của công đoạn khử khoáng bằng HCl
STT U1 U2 Y(%)
5 0,7 7 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
6 0,7 7
7 0,7 7
U1 : Nồng độ HCl (M)
U2: Thời gian xử lí ngâm HCl (giờ)
2.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HÓA H ỌC:[1]
2.3.1. Xác định hàm lượng ẩm bằng phương pháp sấy ở nhiệt độ 105oC theoTCVN 3700-1990. TCVN 3700-1990.
2.3.2. Xác định hàm lượng khoáng bằng phương pháp nung ở 600oC.2.3.3. Xác định hàm lượng protein theo ph ương pháp Microbiuret: 2.3.3. Xác định hàm lượng protein theo ph ương pháp Microbiuret:
Nguyên lý: Trong môi trường kiềm, protein kết hợp với Cu++ thành một phức chất màu tím (phản ứng biuret). Màu sắc của phức chất t ỷ lệ với số liệu peptid (-CO-NH) của protein và gần như không phụ thuộc vào nồng độ tương đối giữa albumin và globulin.
Hình 15.Công thức của phức Biuret.
2.3.3.1. Dụng cụ
-Dụng cụ thủy tinh(ống nghiệm, cốc thủy tinh, ống đong, bình định mức, bình tam giác, pipette), v ật liệu thông thường của phòng thí nghiệm
- Micropipet (100-1000μl) -Thiết bị đo UV-Vis mini1240
2.3.3.2. Hóa chất- NaOH - NaOH - Na2CO3 (Sodium Cabonate) - CuSO4.5H2O - Na3C6H5O7.2H2O (Sodium citrate) 2.3.3.3. Tiến hành
● Pha dung dịch thuốc thử Microbiuret :
Lấy 173g Sodium citrate và 100g Sodium carbonate, đem hòa tan trong nước nóng nhưng không để nước sôi.
Lấy 17,3g CuSO4 hòa tan trong 100ml n ước cất và thêm vào hỗn hợp trên. Sau đó thêm nước cất vào cho đủ 1 lít.
● Xây dựng đường chuẩn:được bố trí như đã nói ở phần bố trí thí nghiệm ● Xử lý mẫu:
Lấy 1g mẫu + 20ml NaOH 3% →ủ ở 80oC,trong 6 giờ. Sau đó, hỗn hợp này được làm lạnh ở nhiệt độ phòng, rồi sau đó mang đi lọc. Khi lọc, dùng từ 10 -15ml NaOH 3% để rửa bã.
Sau đó đem dịch đi li tâm ở 5000 vòng/15 phút → Lấy dịch → Pha loãng sao cho hàm lương protein n ằm trong dãi bước sóng.
Lấy 4ml + 200μl Microbiuret → đo ở bước sóng 330nm.
Kết quả đo được tương ứng với giá trị y (OD330nm), dựa vào phương trình đường chuẩn tính ra được hàm lượng protein có trong 1 ml dịch. Từ đó tính ra được phần trăm protein có trong mẫu theo công thức tính sau:
100 / ) 100 .( 1000 . 100 . . % Mc m C V protein
V: Thể tích mẫu sau khi pha loãng(ml) C: Hàm lượng protein trong 1 ml(mg/ml) m: Khối lượng mẫu đem đi ủ (gam) Mc: Độ ẩm của mẫu đem đi phân tích (%)
2.3.4. Xác định hàm lượng Protein theo ph ương pháp Biuret:2.3.4.1. Dụng cụ:giống như phương pháp Microbiuret. 2.3.4.1. Dụng cụ:giống như phương pháp Microbiuret.
2.3.4.2. Hóa chất:
NaOH CuSO4.5H2O
C4H4NaKO6.4H2O (Kali Natri tartrat) BSA (Bovine serum albumin)
2.3.4.3. Tiến hành:
Pha thuốc thử Biuret: Hòa tan 2,35375 gam CuSO4.5H2O và 8,0571 gam C4H4NaKO6.4H2O trong 500ml nước cất, khuấy đều và cho thêm 300ml NaOH 10%. Dung dịch trên được khuấy trộn đều rồi làm đầy đến 1000ml bằng nước cất .
Xây dựng đường chuẩn: được bố trí như đã nói ở phần bố trí thí nghiệm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cách 1: Ngâm 3-5gam nguyên liệu khô hoặc 3-10 gam nguyên liệu ướt trong