Microbiuret và phương pháp Biuret
●Xây dựng đường chuẩn cho phương pháp Microbiuret:
Hòa tan 0.1 gam huyết thanh bò (BSA) trong NaOH 3% tạo thành các nồng độ khác nhau sao cho nồng độ protein trong dịch thuộc khoảng từ 0.05 -0.5g/l.
Xay nhỏ Tách protein bằng enzyme Alcalase Bã đã tách protein Dịch protein Tỉ lệ E/NL:0,42% Nhiệt độ: 56oC Thời gian:8,8 giờ
Khử protein bằng NaOH
Nồng độ:2,4% Thời gian:12,2 giờ. Nhiệt độ phòng
Khử khoáng bằng HCl
Chitin
Nồng độ:1,2M Thời gian:16 giờ Nhiệt độ phòng Đầu tôm
Chuẩn bị 7 ống nghiệm sạch, đánh số thứ tự từ 1 đến 7, sau đó cho các dung dịch hóa chất vào các ống nghiệm với thể tích và thứ tự nh ư sau:
Bảng 3.Bố trí thí nghiệm chạy đường chuẩn của phương pháp Microbiuret
Ống nghiệm Nồng độ Số ml dịch BSA(ml) Số ml NaOH 3%(ml)
1 0 0 4 2 0,05 0,2 3,8 3 0,1 0,4 3,6 4 0,2 0,8 3,2 5 0,3 1,2 2,8 6 0,4 1,6 2,4 7 0,5 2 2
Sau đó lấy mỗi mẫu 4ml, thêm vào đó 200μl thuốc thử Microbiuret,vortex cho đều và ủ sau 15 phút mang đi đo ở bước sóng 330nm. (Sử dụng ống 0 làm mẫu blank).
●Xây dựng đường chuẩn cho phương pháp Biuret:
Pha dung dịch chuẩn BSA: Hòa tan 0,5 gam BSA vào trong 50ml n ước cất, khuấy dần dần khi BSA tan hết rồi định mức lên 100ml bằng n ước cất (Hàm lượng BSA: 10mg/ml).
Xây dựng đường chuẩn:Chuẩn bị 6 ống nghiệm sạch, đánh số thứ tự từ 0-5 sau đó cho các dung dịch hóa chất vào các ống nghiệm với thể tích và thứ tự nh ư sau:
Bảng 4. Bố trí thí nghiệm chạy đường chuẩn của phương pháp Biuret
Ống nghiệm Dung dịch hóa chất 0 1 2 3 4 5 BSA chuẩn (ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Nước cất (ml) 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Thuốc thử Biuret (ml) 4 4 4 4 4 4 Hàm lượng BSA(mg/ml) 0 2 4 6 8 10
Sau khi đã cho đầy đủ các hóa chất, ủ các ống nghiệm trên ở nhiệt độ phòng trong thời gian 30 phút.
Sau khi ủ, dung dịch trong các ống nghiệm trên được đo mật độ quang học ở bước sóng 570nm để đọc giá trị OD570 (Sử dụng ống 0 làm mẫu blank)
