3.3.5.1 Môi trường nuôi cấy nấm men
Môi trường thường sử dụng nhất hiện nay để nuôi cấy nấm men là môi trường Hansen.
Thành phần môi trường Hansen được trình bày cụ thể ở bảng 3.3.
Bảng 3.3 Thành phần môi trường Hansen.
Tên hóa chất Khối lượng Nơi sản xuất
Glucose 50 g Trung Quốc
K2HPO4 3 g Trung Quốc
Peptone 10 g Difco
MgSO4.&H2O 2.5 g Trung Quốc
Agar 20 g Việt Nam
3.3.5.2 Phương pháp cấy và bảo quản giống nấm men
Chuẩn bị môi trường Hansen có chứa agar. Tiệt trùng, rót dung dịch vào ống nghiệm và để nghiêng đến khi agar đông lại.
Tiến hành gieo cấy giống nấm men từ ống giống gốc của phòng thí nghiệm sang ống môi trường thạch nghiêng đã được chuẩn bị sẵn từ trước (môi trường Hansen có bổ sung thạch với hàm lượng 2%). Công việc này được tiến hành trong tủ cấy vô khuẩn để tránh bị nhiễm các vi sinh vật khác có ảnh hưởng xấu đến men giống và quá trình lên men sau này.
Phương pháp gieo cấy như sau:
Dùng que cấy vòng và vô khuẩn trên đèn cồn.
Tháo nút bông ở ống canh trường giống và ống môi trường. Đốt nóng miệng 2 ống nghiệm trên đèn cồn.
Đưa que cấy vào ống canh trường và lấy một ít canh trường nấm men. Đưa đầu que cấy vào đáy ống môi trường, hòa giọt canh trường vào giọt
nước ngưng ở đáy.
Nhẹ nhàng và từ từ kéo đầu que cấy lên trên mặt thạch, từ đáy lên theo hình sin.
Lấy que cấy ra, vô khuẩn trên đèn cồn.
Hơ nóng nút bông và miệng 2 ống nghiệm (canh trường và môi trường). Đậy nút bông vào ống nghiệm.
Giống nấm men sau khi được gieo cấy sang môi trường thạch nghiêng được đặt vào tủ ấm và giữ ở nhiệt độ 300C, sau 48 giờ giống đã phát triển tốt, chúng tôi đặt các ống nghiệm vào tủ lạnh (nhiệt độ 4-60C) để bảo quản giống, phục vụ cho quá trình nghiên cứu. Nếu muốn tiếp tục bảo quản thì thời gian sau này cần cấy chuyền sang môi trường mới.
3.3.5.3 Phương pháp nhân giống
Giống nấm men trước khi đưa vào lên men cần được nhân giống nhằm tăng sinh khối, tăng hoạt lực giống. Ở quy mô phòng thí nghiệm, chúng tôi tiến hành nhân giống qua hai cấp:
Nhân giống cấp 1: sau khi nấm men đã phát triển trên môi trường thạch nghiêng, chúng tôi cấy vào ống nghiệm chứa 10ml dịch môi trường Hansen
CHƯƠNG 3: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
45
không chứa agar đã được hấp tiệt trùng, tiếp đó nuôi ở nhiệt độ thường (28- 300C) trong 24 giờ.
Nhân giống cấp 2: lấy 100 ml dịch môi trường Hansen không chứa agar cho vào erlen 250ml, hấp tiệt trùng, để nguội, cho toàn bộ nấm men trong ống nghiệm đã nuôi giống (nhân giống cấp 1) vào erlen và nuôi ở điều kiện 300C trong tủ ủ lắc (tốc độ lắc 130 rpm), thời gian kết thúc nhân giống cấp 2 thường là 24 giờ.
3.3.5.4 Phương pháp đếm nấm men
Để đánh giá chất lượng canh trường nấm men, cần đếm số tế bào trong 1ml. Trong 1ml canh trường nấm men phát triển bình thường phải có ít nhất 12-14 triệu tế bào. Chúng tôi đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu.
a. Tiến hành
Đặt lá kính lên khu vực buồng đếm.
Lắc đều dịch tế bào nấm men và dùng pipet pasteur để lấy một giọt cho vào khe ở mép buồng đếm, tránh tạo bọt khí. Dịch huyền phù sẽ đi vào buồng đếm nhờ cơ chế mao dẫn.
Đặt buồng đếm vào bàn kính hiển vi và để yên vài phút.
Chỉnh kính hiển vi với vật kính x40, tìm mạng ô đếm ở khu vực buồng đếm. Chỉnh thị trường sao cho một thị trường chứa trọn một ô lớn (4 x 4 = 16 ô nhỏ).
Đếm số tế bào trong 5 ô vuông lớn đại diện cho 25 ô vuông lớn trong ô trung tâm.
b. Cách tính
Số lượng tế bào trong 1 ml mẫu nghiên cứu được tính bằng công thức: N = [(a/b)x 400/0,1] x 103 x 10n
Trong đó:
N : số lượng tế bào trong 1ml mẫu nghiên cứu, a : số tế bào trong 5 ô vuông lớn (80 ô vuông nhỏ), b : số ô vuông nhỏ trong 5 ô vuông lớn,
400 : tổng số ô vuông nhỏ trong ô trung tâm, 0,1 : thể tích dịch tế bào chứa trong ô trung tâm, 103 : số chuyển mm3 thành ml,
10n: độ pha loãng mẫu.