2.4.3.1 Khái quát
Quá trình thủy phân cellulose được thực hiện bởi axit thủy phân hoặc enzyme thủy phân. Vào cuối thế kỉ 19 và đầu thế kỉ 20, quá trình thủy phân được thực hiện bởi phản ứng giữa cellulose với axit. Axit loãng được sử dụng dưới điều kiện nhiệt độ cao và áp suất cao, còn axit đậm đặc được sử dụng ở nhiệt độ thấp và áp suất khí quyển. Quá trình thủy phân bằng axit loãng xảy ra ở điều kiện nhiệt độ và áp suất cao dẫn đến sự tạo thành các chất độc hại có thể ảnh hưởng không tốt đến quá trình lên men như các acid hữu cơ có trọng lượng phân tử thấp, dẫn xuất furan và các hợp chất vô cơ. Các mắt xích của cellulose có thể bị phân cắt thành các phân tử đường glucose riêng lẻ bằng enzyme cellulase.
Phương trình phản ứng:
( ) + ⎯⎯⎯⎯
2.4.3.2 Enzyme cellulase
a. Khái niệm
Enzyme cellulase là loại enzyme được sản xuất từ nấm mốc, vi khuẩn hoặc sinh vật đơn bào có vai trò xúc tác cho phản ứng thủy phân cellulose [23]. b. Yêu cầu đối với cellulase
Sự phát triển của quá trình chuyển hóa biomass - một nguồn nguyên liệu thô, ít giá trị, thành bioethanol thông qua quá trình lên men đặt ra yêu cầu một
số bước đặc biệt là việc sản xuất enzyme cellulase cần phải được tối ưu. Sản xuất cellulase quan trọng vì việc thủy phân cellulose có hiệu quả cần một lượng lớn enzyme cellulase (1kg cellulase cho 50 kg cellulose). Giá của enzyme này khá cao 0.3 - 0.81 dollar/gam. Hiện nay, yêu cầu cụ thể đặt ra với enzyme là cellulase có giá thành rẻ, hoạt tính đặc hiệu cao, độ ổn định cao, chịu được pH và nhiệt độ [7].
c. Nhóm enzyme cellulase
Mặc dù là loại polymer sinh học phong phú, cellulose lại rất bền vững và khó bị phá vỡ vì cellulose có độ kết tinh cao, không tan trong nước, có khả năng chống lại các quá trình depolymer hóa. Quá trình thủy phân cellulose tạo thành glucose được thực hiện nhờ sự tác dụng hiệp đồng của 3 nhóm enzyme đặc trưng khác nhau [7]:
+ “Endo-1,4-β-glucanases” (EG) hay 1,4-β-D-glucan 4-glucanohydrolases (EC 3.2.1.4), enzyme này sẽ tấn công ngẫu nhiên vào các cơ chất 1,4-β- glucan cả tan và không tan [7].
+ “Exo -1,4-β-D-glucanases” bao gồm 1,4-β-D-glucan glucohydrolase (EC 3.2.1.74), enzyme này có tác dụng giải phóng D-glucose từ 1,4-β-D-glucan và thủy phân chậm D-cellobiose; ngoài ra còn có enzyme 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) (CBH), enzyme này sẽ giải phóng cellobiose từ 1,4-β-glucan [7].
+ “β-D-glucosidase” hay còn gọi là β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) có tác dụng tạo thành D-glucose từ celobiose là cellodextrin, cũng như các olygomer của glucose [7].
Vì vậy, enzyme cellulase là một phức hệ enzyme rất phức tạp, các loại enzyme lần lượt cắt phân tử cellulose để tạo ra sản phẩm cuối cùng là glucose [3]. Trong luận văn này, để tiện việc trình bày nên gọi chung nhóm 3 enzyme này là cellulase.
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
25
Hình 2.10Tác dụng của từng enzyme. d. Các nguồn sản xuất cellulase
Enzyme cellulase là hệ enzym khá phổ biến ở hầu hết các loài vi sinh vật có trong tự nhiên, bao gồm nấm mốc, xạ khuẩn và cả vi khuẩn. Người ta thống kê được có hơn 60 loại nấm mốc có khả năng tạo cellulase, gồm có các loại chính là soft-rot, brown-rot và white-rot. Các loại nấm mốc thuộc nhóm cuối cùng (white-rot) có thể phân hủy cả cellulose và lignin [7].
e. Cấu trúc enzyme cellulase
Trong những năm 1970, nhờ những phát triển trong lĩnh vực hóa sinh và sinh học phân tử, người ta có thể nghiên cứu được cấu trúc của cellulase thông qua giống nấm mốc Trichoderma reesi. Đây là chủng nấm mốc phổ biến sản sinh ra enzyme cellulase [7]. Vào cuối những năm 1980, Abuja và cộng sự đã đề nghị cấu trúc bậc 3 của Trichoderma reesei CBH I (enzyme thủy phân cellobiose I - cellobiohydrolase I) và CBH II [7]. Trong đó, enzyme gồm:
+ Trung tâm tạo liên kết với cellulose (CBD: cellulose binding domain) có kích thước nhỏ hơn. Nghiên cứu cấu trúc của trung tâm tạo liên kết với cellulose CBD của CBH I cho thấy đây là một chuỗi polypeptide gồm có 36 amino acid và có một mặt thể hiện tính chất kỵ nước mạnh. Về mặt lý thuyết, có thể kết luận rằng CBD có vai trò quan trọng trong việc ổn định sự liên kết tạm thời giữa cellulase và bề mặt cellulose. Trên bề mặt cellulose có vùng kỵ nước là do sự sắp xếp chặt chẽ và do liên kết hydrogen mạnh giữa các mạch cellulose, góp phần ngăn cản, không cho các phân tử lớn như nước xâm nhập vào cấu trúc này. Chính tương tác giữa hai vùng có tính chất kỵ nước của cellulose và CBD mà enzyme được liên kết với cellulose [7].
+ Cầu nối peptide: có tác dụng liên kết hai trung tâm này lại với nhau. Đối với enzyme cellulase, cầu nối peptide là một vùng ái đường, được cấu tạo bởi các amino acid serine, threonin và praline [7].
Đối với T. reesei CBH II, lõi protein có tác dụng phá vỡ cấu trúc vi sợi của cellulose. Sản phẩm thủy phân của CHB I giữ nguyên cấu trúc lập thể của C1(C chứa nhóm OH hemiacetal), trong khi đó CBH II tạo sự nghịch đảo cấu hình của C1 thành đồng phân α [7].
Cellulase có nguồn gốc từ các giống nấm mốc khác cũng như từ vi khuẩn đều có cấu trúc tương tự [7].
f. Cơ chế tác dụng của enzyme
Khi có sự tham gia xúc tác của các enzyme, cơ chất sẽ được hoạt hóa mạnh. Cơ chất tương tác với enzyme do sự cực hóa, sự chuyển dịch của các electron, sự biến dạng các liên kết. Từ đó làm thay đổi động năng, thế năng dẫn tới cơ chất trở nên dễ dàng tham gia vào các phản ứng hơn. Quá trình xúc tác của enzyme xảy ra qua ba giai đoạn [3]:
E +S ESE + P
Trong đó: E - enzyme; S - cơ chất; P - sản phẩm
Enzyme sẽ kết hợp với cơ chất bằng những liên kết yếu, nhờ đó sẽ tạo ra phức hợp ES, phức này không bền. Giai đoạn thường này xảy ra rất nhanh và đòi hỏi một ít năng lượng [3].
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
27
Cơ chất bị biến đổi, dẫn tới làm căng, phá vỡ các liên kết đồng hóa trị [3]. Sản phẩm được tạo thành, tách ra khỏi enzyme, enzyme được giải phóng và
trở lại trạng thái tự do [3].