3.3.2.1 Nguyên lý
Xử lý biomass với lần lượt với các loại hóa chất khác nhau nằm loại bỏ lần lượt các thành phần trong biomass. Thông qua đó, giúp xác định các thành phần xơ sợi chính trong biomass gồm cellulose, hemicellulose và lignin.
3.3.2.2 Hóa chất sử dụng
a. Tách chất béo
Dung dịch Ethanol/Benzene với tỷ lệ 1:2.
Bảng 3.1 Thành phần dung dịch NDS
STT Hóa chất Lượng
1 Nước cất 1 lít
2 EDTA 18.61 g
3 Natri tetraborat decahydrate 6.81 g
4 Natri dodecyl Sulfate 30 g
5 2-ethoxyethanol 10 ml
6 Dinatri hydrophosphate 4.56 g
Trước tiên hòa tan 2 và 3 vào 1; sau đó hòa tan 4 và 5 vào dung dịch vừa pha, cuối cùng hòa tan 6 vào dung dịch. Dung dịch thu được có pH trung tính (6.9- 7.1).
c. Dung dịch ADS Gồm có:
+ Acid sulfuric (96∼98%) : 49.04g
+ CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) : 20g
Hòa tan hai chất trên vào nước, sau đó định mức đến 1 lít, sử dụng bình định mức.
d. Các hóa chất khác
+ Decahydro Naphtalene (hỗn hợp của cis và trans)
+ Natri sulfite
+ Acetone
3.3.2.3 Trình tự tiến hành
a. Chuẩn bị mẫu
CHƯƠNG 3: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
35
Cắt nhỏ mẫu, sử dụng máy nghiền. Trong đề tài này, bã mía được cắt nhỏ đến kích thước cần thiết bằng cối xay thịt.
Hình 3.3 Bã mía sau khi qua máy nghiền
Chiết tách các chất béo có trong mẫu, sử dụng soxhlet với hệ dung môi Ethanol/Benzene.
Làm khô dung môi.
Sấy mẫu trong tủ sấy ở nhiệt độ 1050C.
b. Tách chất béo bằng dung môi ethanol/benzene
Chuẩn bị túi bằng giấy lọc để đựng nguyên liệu, gấp giấy lọc thành túi trụ (kiểu gói thuốc) có đường kính bé hơn trụ chiết.
Cân 10g mẫu (mmẫu) đã được nghiền nhỏ và sấy khô đến khối lượng không đổi, cho vào túi giấy. Gấp kín mép túi, cân khối lượng túi giấy có mẫu W’1 = (các thành phần khác của biomass + giấy lọc + chất béo), và đặt túi vào trụ chiết.
Chuẩn bị 300 ml hệ dung môi Ethanol/Benzene với tỷ lệ 1:2. Cho vào bình cầu có dung tích 500ml.
Lắp hệ thống soxhlet như hình 3.5.
Lấy túi giấy ra khỏi soxhlet, sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 1050C trong vòng 8 giờ.
Cân lại khối lượng túi giấy, W’2 = (các thành phần khác của biomass + giấy lọc).
Tính lượng chất béo đã tách ra: W’ = W’1 – W’2
Trữ mẫu đã tách béo để sử dụng cho các bước phân tích tiếp theo. c. Phân tích thành phần NDS
Bước phân tích này nhằm đo tổng lượng xơ sợi (hemcellulose, cellulose và lignin) trong biomass. Bằng cách cho biomass phản ứng với NDS, NDS là một hệ chất có tác dụng tẩy rửa, hòa tan các chất trích ly, còn lại xơ sợi và tro.
Các bước thực hiện:
Cho 100ml dung dịch NDS, 2ml Decahydro Naphtalene và 0.5g Natri sulfite vào 0.5g mẫu (m1).
Lắp hệ thống gồm sinh hàn như hình 3.4
CHƯƠNG 3: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
37
Đun hỗn hợp sôi (thường cần 5 - 10 phút ban đầu để chỉnh bếp đun) giữ cho hỗn hợp sôi trong vòng 60 phút.
Lọc dung dịch bằng phễu Gooch Crucible, sau đó rửa bằng nước sôi (vài lần) và bằng acetone (2 lần).
Sấy khô Crucible ở nhiệt độ 1050C trong vòng 8h sau đó cân khối lượng Crucible (W1).
W1 = xơ sợi (cellulose + hemicellulose + lignin) + tro + crucible
Nung Crucible trong lò nung (500-5500C) trong 3 giờ, sau đó để nguội lò nung và cân lại khối lượng Crucible (W2)
W2 = tro + crucible Tính khối lượng xơ sợi:
Xơ sợi (cellulose + hemicellulose + lignin) = W1 – W2 d. Phân tích thành phần ADS
Bước này nhằm xác định phần cellulose và lignin trong biomass. Bằng cách cho biomass phản ứng với dung dịch ADS, acid trong ADS sẽ thủy phân hemicellulose, CTAB và acid sẽ hòa tan các chất trích ly, phần còn lại là cellulose, lignin, tro.
Cho 100ml dung dịch ADS, 2ml decahydronaphtalene vào 1g mẫu (m2). Lắp dụng cụ giống với bước làm NDS.
Đun nóng hỗn hợp đến sôi , giữ ở trạng thái sôi trong 60 phút.
Lọc hỗn hợp bằng phễu Gooch Crucible, đồng thời nghiền bã trên phễu lọc bằng đủa thủy tinh và rửa bã bằng nước sôi 2 lần. Sau đó rửa bằng acetone đến khi acetone sau rửa không màu.
Sấy khô Crucible ở 1050C, sau 8h, cân khối lượng bã W3 W3= cellulose + lignin + tro + crucible.
e. Phân tích thành phần ADL
Bước này nhằm xác định thành phần lignin trong biomass. Bằng cách xử lý bã sau ADS bằng H2SO4 72%, acid này sẽ hòa tan cellulose, chỉ còn lại lignin và tro.
Sau khi xác định khối lượng phần ADS (W3), thêm 10ml H2SO4 72% khối lượng vào phễu crucible, đảo trộn và nghiền bằng đủa thủy tinh tạo dạng paste. Sau đó tiếp tục khuấy trộn trong vòng 1 giờ. Để acid và dung dịch H2SO4 và các chất hòa tan chảy tự do xuống, nếu tất cả acid đều chảy xuống trước 1 giờ, cho thêm 10ml acid.
Sau khi tất cả acid đã chảy xuống sau 1 giờ, cho thêm 10ml H2SO4. Tiếp tục bước trên 3 lần nữa (3 giờ).
Sau đó rửa bã trên crucible với lượng dư nước sôi.
Sấy khô crucible trong tủ sấy ở 1050C trong vòng 8 giờ, sau đó cân khối lượng crucible W4
W4= lignin + tro + crucible
Đun crucible trong lò nung, nhiệt độ 500 - 5500C, trong 3 giờ, sau đó cân lại crucible.
W5 = tro + crucible Tính khối lượng lignin: Lignin = W4– W5
f. Phân tích tro
Cân 1g mẫu đã qua cắt nhỏ, rây, sấy khô ở 1050C đến khối lượng không đổi. Cân chính xác khối lượng mẫu và ghi lại (m3).
Cân khối lượng cốc nung m4. Cho mẫu vào cốc nung.
CHƯƠNG 3: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 3.3.2.4 Tính kết quả + Phần trăm chất béo: % ℎấ é = W’ ẫ 100% = W’ – W’ ẫ 100%
+ Phần trăm các thành phần xơ sợi:
% = = − 100% % = − = − 100% % = − = − 100% − % − % + Phần trăm tro: % = − 100% + Phần trăm chất trích ly: % ℎấ í ℎ = 100% − % ơ ợ − %
3.3.3 Phương pháp định lượng đường gluocse
Trong luận văn này lượng đường glucose tạo thành sau quá trình thủy phân bằng enzyme được xác định bằng phương pháp DNS.
3.3.3.1 Nguyên tắc
Có vài tác nhân được sử dụng để định lượng đường nhờ các đặc tính khử của đường. 3,5- Dinitrosalicylic acid (DNS) có màu vàng trong dung dịch kiềm sẽ bị khử thành acid 3-amino-5-nitrosalicylic có màu đỏ cam.
COO OH O2N COO- OH NH2 O2N NO2
Màu vàng Màu đỏ cam
3.3.3.2 Hóa chất và dụng cụ
Dung dịch thuốc thử Dinitrosalicylic dùng cho phản ứng
Hòa tan 10g DNS vào 400 ml nước cất. Khuấy trên bếp khuấy từ. Hòa tan 16g NaOH với 150 ml nước cất.
Thêm dung dịch NaOH vừa pha từ từ vào dung dịch DNS ở trên. Sử dụng máy khuấy từ để hòa tan, nhiệt độ không quá 500C. Tiếp tục thêm 300g Potassium sodium tartrate.
Để nguội về nhiệt độ phòng, định mức đủ 1lít, sau đó trữ trong chai tối,tránh ánh sáng.
Dung dịch đường chuẩn: Pha 0.1g glucose vào nước cất. Sau đó thêm nước đến 20ml. Dung dịch có nồng độ 5mg/ml.
3.3.3.3 Phương pháp
Chỉ pha chế dung dịch thuốc thử DNS dùng cho phản ứng trước khi sử dụng, dung dịch này cần phải được giữ trong chai nâu và tránh CO2.
Hút 3ml dung dịch mẫu có chứa đường vào một ống nghiệm. Thêm vào 1 ml thuốc thử DNS.
Chuẩn bị ống thử không bằng cách thêm 1 ml thuốc thử DNS vào 3 ml nước cất.
Dùng một miếng nilon sạch bịt kín đầu ống nghiệm, đặt vào nồi nước sôi đang sôi trong 5 phút.
Làm lạnh về nhiệt độ phòng và đo độ hấp thu OD ở bước sóng 540 nm. Dùng ống thử không để chuẩn độ truyền suốt về 100%. Chú ý là tất cả các ống nghiệm cần phải được làm lạnh về nhiệt độ phòng trước khi đo bởi vì độ hấp thu rất nhạy với nhiệt độ.
Dựa vào đường chuẩn suy ra nồng độ đường có trong dung dịch.
3.3.3.4 Dựng đồ thị chuẩn
a. Phương pháp tiến hành
Dung dịch đường chuẩn thí nghiệm: dung dịch đường có nồng độ 5 mg/ml. Sử dụng bính định mức.
Hút lần lượt 1, 2, 3, 4 và 5 ml dung dịch đường này vào 5 bình định mức 50 ml. Thêm nước cho đến vạch định mức.
CHƯƠNG 3: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
41
Các dung dịch đường mới pha này có nồng độ glucose lần lượt là 0.10, 0.20, 0.30, 0.40 và 0.50 mg/ml.
Thực hiện phản ứng như trên.
Vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên giữa nồng độ đường và độ hấp thu OD ở bước sóng 540nm.
b. Kết quả
Kết quả dựng đồ thị chuẩn glucose được trình bày ở bảng 3.2 và hình 3.6
Bảng 3.2Kết quả đồ thị chuẩn. Nồng độ glucose (g/l) OD1 OD2 OD3 ODtb 0.1 0.225 0.223 0.225 0.224 0.2 0.583 0.58 0.583 0.582 0.3 0.895 0.895 0.894 0.895 0.4 1.247 1.248 1.248 1.248 0.5 1.523 1.523 1.525 1.524
Hình 3.6Đồ thị đường chuẩn glucose.
y = 0.3058x + 0.0264 R² = 0.9983 0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 0.600 0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 1.200 1.400 1.600 N ồn g độ Gl uc os e (g/ l) OD540nm
Từ đồ thị đường chuẩn ta xác định được nồng độ đường glucose có trong mẫu nghiên cứu.
3.3.4 Phương pháp xác định độ cồn
Xác định độ cồn bằng phương pháp dùng bình tỷ trọng picromet tương đối đơn giản, nhanh chóng và khá chính xác.
a. Định nghĩa độ cồn
Độ cồn là số ml rượu etylic nguyên chất trong 100 ml rượu thử ở nhiệt độ 200C. b. Chưng cồn
Lắp hệ thống chưng cồn. Lấy 100 ml dịch mẫu, thêm vào 50 ml nước cất, cho tất cả vào bình cầu và tiến hành chưng cất.
Hứng dung dịch cồn chưng được, cắm nhiệt kế và đầu ống sinh hàn vào bình hứng, nhúng ngập trong 10 ml nước cất ở nhiệt độ 200C.
Duy trì cồn chưng được ở nhiệt độ 200C từ lúc bắt đầu chưng cất cho đến lúc hoàn tất thao tác cân bình tỷ trọng.
Khi dung dịch cồn thu được gần đến vạch 100 ml thì quá trình chưng cất kết thúc. Định mức nhanh dung dịch cồn thu được đến 100ml và tiến hành đo tỷ trọng.
c. Đo tỷ trọng
Rửa sạch bình tỷ trọng dung tích 50 ml bằng nước cất, tráng kỹ bằng cồn 960 và đem đi sấy nhẹ ở 500C trong 30 phút.
Để nguội và mang đi cân để xác định khối lượng bình.
Cho nước cất đã làm lạnh đến 200C vào đầy bình tỷ trọng, lau sạch phía ngoài bình và cân.
Ghi nhận khối lượng bình và nước cất.
Lặp lại thao tác như khi cân nước cất, để xác định trọng lượng bình chứa cồn chưng cất được.
CHƯƠNG 3: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
43
Chú ý: Duy trì nhiệt độ bình và dung dịch cần đo ở 200C. Thao tác cần nhanh và chính xác.
d. Tính kết quả
Tỷ trọng tương đối của rượu được tính như sau:
= −−
m: khối lượng bình tỷ trọng (g) m1: khối lượng bình và rượu (g) m2: khối lượng bình và nước cất (g)
Từ tỷ trọng tương đối, tra bảng Phụ lục 1 bên dưới (trang 88) để xác định độ cồn ở nhiệt độ tiêu chuẩn 200C sẽ biết được nồng độ rượu trong chất lỏng.
3.3.5 Phương pháp nuôi cấy và đếm nấm men
3.3.5.1 Môi trường nuôi cấy nấm men
Môi trường thường sử dụng nhất hiện nay để nuôi cấy nấm men là môi trường Hansen.
Thành phần môi trường Hansen được trình bày cụ thể ở bảng 3.3.
Bảng 3.3 Thành phần môi trường Hansen.
Tên hóa chất Khối lượng Nơi sản xuất
Glucose 50 g Trung Quốc
K2HPO4 3 g Trung Quốc
Peptone 10 g Difco
MgSO4.&H2O 2.5 g Trung Quốc
Agar 20 g Việt Nam
3.3.5.2 Phương pháp cấy và bảo quản giống nấm men
Chuẩn bị môi trường Hansen có chứa agar. Tiệt trùng, rót dung dịch vào ống nghiệm và để nghiêng đến khi agar đông lại.
Tiến hành gieo cấy giống nấm men từ ống giống gốc của phòng thí nghiệm sang ống môi trường thạch nghiêng đã được chuẩn bị sẵn từ trước (môi trường Hansen có bổ sung thạch với hàm lượng 2%). Công việc này được tiến hành trong tủ cấy vô khuẩn để tránh bị nhiễm các vi sinh vật khác có ảnh hưởng xấu đến men giống và quá trình lên men sau này.
Phương pháp gieo cấy như sau:
Dùng que cấy vòng và vô khuẩn trên đèn cồn.
Tháo nút bông ở ống canh trường giống và ống môi trường. Đốt nóng miệng 2 ống nghiệm trên đèn cồn.
Đưa que cấy vào ống canh trường và lấy một ít canh trường nấm men. Đưa đầu que cấy vào đáy ống môi trường, hòa giọt canh trường vào giọt
nước ngưng ở đáy.
Nhẹ nhàng và từ từ kéo đầu que cấy lên trên mặt thạch, từ đáy lên theo hình sin.
Lấy que cấy ra, vô khuẩn trên đèn cồn.
Hơ nóng nút bông và miệng 2 ống nghiệm (canh trường và môi trường). Đậy nút bông vào ống nghiệm.
Giống nấm men sau khi được gieo cấy sang môi trường thạch nghiêng được đặt vào tủ ấm và giữ ở nhiệt độ 300C, sau 48 giờ giống đã phát triển tốt, chúng tôi đặt các ống nghiệm vào tủ lạnh (nhiệt độ 4-60C) để bảo quản giống, phục vụ cho quá trình nghiên cứu. Nếu muốn tiếp tục bảo quản thì thời gian sau này cần cấy chuyền sang môi trường mới.
3.3.5.3 Phương pháp nhân giống
Giống nấm men trước khi đưa vào lên men cần được nhân giống nhằm tăng sinh khối, tăng hoạt lực giống. Ở quy mô phòng thí nghiệm, chúng tôi tiến hành nhân giống qua hai cấp:
Nhân giống cấp 1: sau khi nấm men đã phát triển trên môi trường thạch nghiêng, chúng tôi cấy vào ống nghiệm chứa 10ml dịch môi trường Hansen
CHƯƠNG 3: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
45
không chứa agar đã được hấp tiệt trùng, tiếp đó nuôi ở nhiệt độ thường (28- 300C) trong 24 giờ.
Nhân giống cấp 2: lấy 100 ml dịch môi trường Hansen không chứa agar cho vào erlen 250ml, hấp tiệt trùng, để nguội, cho toàn bộ nấm men trong ống nghiệm đã nuôi giống (nhân giống cấp 1) vào erlen và nuôi ở điều kiện 300C trong tủ ủ lắc (tốc độ lắc 130 rpm), thời gian kết thúc nhân giống cấp 2 thường là 24 giờ.
3.3.5.4 Phương pháp đếm nấm men
Để đánh giá chất lượng canh trường nấm men, cần đếm số tế bào trong 1ml. Trong 1ml canh trường nấm men phát triển bình thường phải có ít nhất 12-14 triệu tế bào. Chúng tôi đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu.
a. Tiến hành
Đặt lá kính lên khu vực buồng đếm.
Lắc đều dịch tế bào nấm men và dùng pipet pasteur để lấy một giọt cho vào khe ở mép buồng đếm, tránh tạo bọt khí. Dịch huyền phù sẽ đi vào buồng đếm nhờ cơ chế mao dẫn.
Đặt buồng đếm vào bàn kính hiển vi và để yên vài phút.
Chỉnh kính hiển vi với vật kính x40, tìm mạng ô đếm ở khu vực buồng đếm. Chỉnh thị trường sao cho một thị trường chứa trọn một ô lớn (4 x 4 = 16 ô nhỏ).
Đếm số tế bào trong 5 ô vuông lớn đại diện cho 25 ô vuông lớn trong ô trung tâm.
b. Cách tính
Số lượng tế bào trong 1 ml mẫu nghiên cứu được tính bằng công thức: N = [(a/b)x 400/0,1] x 103 x 10n
Trong đó:
N : số lượng tế bào trong 1ml mẫu nghiên cứu, a : số tế bào trong 5 ô vuông lớn (80 ô vuông nhỏ), b : số ô vuông nhỏ trong 5 ô vuông lớn,
400 : tổng số ô vuông nhỏ trong ô trung tâm, 0,1 : thể tích dịch tế bào chứa trong ô trung tâm, 103 : số chuyển mm3 thành ml,
10n: độ pha loãng mẫu.
3.4 Trình tự nghiên cứu
Nghiên cứu này tập trung vào hai quá trình chính là quá trình thủy phân và quá trình thủy phân và lên men đồng thời.
3.4.1 Sơ đồ quy trình
Hình 3.7Sơ đồ quy trình sản xuất ethanol sinh học từ bã mía. 400 : tổng số ô vuông nhỏ trong ô trung tâm,
0,1 : thể tích dịch tế bào chứa trong ô trung tâm, 103 : số chuyển mm3 thành ml,
10n: độ pha loãng mẫu.
3.4 Trình tự nghiên cứu
Nghiên cứu này tập trung vào hai quá trình chính là quá trình thủy phân và quá