Các mẫu khảo sát dƣới đây đƣợc tiền xử lý với 15% giống. Kết quả khảo sát hàm lƣợng đƣờng và hiệu suất chuyển hóa theo sự thay đổi của % enzyme đƣa vào khi đƣờng hóa đƣợc thể hiện ở bảng và hình theo sau.
Bảng 4.13: Kết quả khảo sát tỉ lệ enzyme trong quá trình đƣờng hóa lõi bắp Mẫu % Cơ chất % Enzyme Đƣờng tổng (g/l) Hiệu suất (%)
1 5% 5 2.88 9.60 2 5% 6 2.71 9.04 3 5% 7 3.30 10.99 4 5% 8 3.62 12.06 5 5% 9 3.67 12.25 6 5% 10 4.92 16.40 7 5% 12 4.82 16.08
Dựa vào đồ thị ta thấy, hàm lƣợng đƣờng và hiệu suất chuyển hóa tăng khi ta tăng lƣợng enzyme sử dụng. Hàm lƣợng đƣờng tăng chậm với nồng độ enzyme từ 5% đến 9% và tăng đáng kể ở nồng độ từ 9% đến 12%.
Tỉ lệ enzyme phù hợp là 10% và ta không nên tăng thêm lƣợng enzyme vì khi tăng lƣợng enzyme thì tốc độ phản ứng tăng, lƣợng đƣờng tạo ra nhiều sẽ gây ức chế lại enzyme và tăng chi phí sử dụng enzyme
Ứng với một lƣợng cơ chất nhất định , lƣợng enzyme sử dụng cũng có một giới hạn. Trƣớc tiên enzyme sẽ tấn công vào phần cellulose vô đinh hình, khi phần cellulose này giảm dần tốc độ phản ứng cũng giảm dần, khả năng enzyme thủy phân phần cellulose còn lại là rất khó. Do đó dù có tăng thêm lƣợng enzyme thì hiệu suất chuyển hóa cũng không tăng thêm nhiều. Enzyme đóng vai trò quan trọng trong quá trình đƣờng hóa và ta cần chọn nồng độ enzyme phù hợp để đảm bảo hiệu quả kinh tế lẫn kỹ thuật.
Trang 44 (a) (b) Hình 4.4: Đồ thị khảo sát tỉ lệ enzyme 0 1 2 3 4 5 6 0 2 4 6 8 10 12 14 Khảo sát tỉ lệ enzyme % enzyme Đƣờng tổng (g/l) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0 2 4 6 8 10 12 14 Khảo sát tỉ lệ enzyme % enzyme Hiệu suất (%)
Trang 45
4.5. Khảo sát tỉ lệ enzyme bán tinh khiết
Phƣơng pháp tủa enzyme bằng cồn khá đơn giản. Sau 15h, phần dịch và enzyme bị tủa đã phân lớp (hình 4.5).
Hình 4.5: Enzyme tủa trong cồn
Bảng 4.14: Kết quả xác định hoạt tính enzyme đƣợc thể hiện ở bảng sau.
Mẫu CMCase
Enzyme thƣơng mại 1208.27 U/ml Enzyme thô
Trichoderma reesei 11.18 U/g chế phẩm thô
Aspergillus niger 20.65 U/g chế phẩm thô
Enzyme bán tinh khiết
Trichoderma reesei 17.69 U/g enzyme bán tinh khiết
Aspergillus niger 34.21 U/g enzyme bán tinh khiết
Bảng 4.15: Kết quả đƣờng hóa lõi bắp bằng enzyme bán tinh khiết
Mẫu % Cơ chất Enzyme (%g/g) Đƣờng tổng (g/l) Hiệu suất (%)
1 5% 2% 2.3151 7.72
2 5% 4% 2.3717 7.91
3 5% 8% 2.5415 8.47
Trang 46
(a)
(b)
Hình 4.6: Đồ thị khảo sát tỉ lệ enzyme bán tinh khiết 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 0 2 4 6 8 10 12 14
Khảo sát tỉ lệ enzyme bán tinh khiết
% enzyme Đƣờng tổng (g/l) 0 2 4 6 8 10 12 14 0 2 4 6 8 10 12 14
Khảo sát tỉ lệ enzyme bán tinh khiết (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
% enzyme Hiệu suất (%)
Trang 47
Kết quả thu nhận đƣợc từ quá trình đƣờng hóa sử dụng enzyme bán tinh khiết cũng tƣơng tụ với quá trình đƣờng hóa bằng enzyme thƣơng mại. Hàm lƣợng đƣờng tỉ lệ thuận với lƣợng enzyme sử dụng.
Ta thu đƣợc 3.29 g và 2.26 g enzyme bán tinh khiết từ 40 g chế phẩm enzyme thô
Trichderma reesei và Aspergillus niger. Với lƣợng enzyme bán tinh khiết thu đƣợc và
tỉ lệ enzyme 12% (tƣơng ứng với 0.6 g/5 g cơ chất khan, tỉ lệ phối trộn mỗi loại enzyme là 1:1) thì lƣợng enzyme sử dụng là khá lớn, lƣợng đƣờng thu nhận đƣợc không cao so với enzyme thƣơng mại.
4.6. Khảo sát tỉ lệ cơ chất
Kết quả khảo sát hàm lƣợng đƣờng và hiệu suất chuyển hóa theo sự thay đổi của % cơ chất khi đƣờng hóa đƣợc thể hiện ở bảng và hình theo sau.
Khi lƣợng cơ chất tăng thì tốc độ phản ứng cũng tăng. Khi nồng độ cơ chất cao, sản phẩm thủy phân trong dung dịch ở mức đậm đặc hơn trở thành chất ức chế enzyme và quá trình khuếch tán chất hòa tan sẽ khó khăn hơn.
Hiệu suất chuyển hóa giảm và hàm lƣợng đƣờng thu đƣợc tăng khi tăng nồng độ cơ chất. Hay nói cách khác, với cùng một lƣợng enzyme thì nồng độ cơ chất càng nhỏ, hiệu suất chuyển hóa càng cao do enzyme dễ tiếp xúc với cơ chất hơn, dung dịch càng loãng quá trình khuếch tán dễ dàng xảy ra sẽ hạn chế tác động của chất ức chế lên enzyme.
Hiệu suất là thông số thể hiện việc sử dụng hiệu quả nguyên liệu và hàm lƣợng đƣờng ảnh hƣởng đến quá trình thu nhận ethanol. Lƣợng đƣờng càng cao thì quá trình lên men tạo ethanol đạt sản lƣợng lớn giúp tiết kiệm chi phí cô đặc dịch lên men và quá trình chƣng cất.
Bảng 4.16: Kết quả khảo sát tỉ lệ cơ chất trong quá trình đƣờng hóa lõi bắp Mẫu % Enzyme % Cơ chất Đƣờng tổng (g/l) Hiệu suất (%)
1 10% 2 2.01 16.78 2 10% 5 4.92 16.40 3 10% 8 7.96 16.58 4 10% 11 10.36 15.70 5 10% 14 13.19 15.71 6 10% 17 22.03 21.60 7 10% 20 26.96 22.46
Trang 48 (a) (b) Hình 4.7: Đồ thị khảo sát tỉ lệ cơ chất 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 0 5 10 15 20 25 Khảo sát tỉ lệ cơ chất % Cơ chất Đƣờng tổng (g/l) 0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25 Khảo sát tỉ lệ cơ chất % Cơ chất Hiệu suất (%)
Trang 49
Ở tỉ lệ cơ chất là 20%, hiệu suất chuyển hóa chỉ đạt 22.46%, trong nguyên liệu còn lại đến hơn 40% (cellulose và hemicellulose) chƣa đƣợc đƣờng hóa. Nguyên nhân là do kích thƣớc nguyên liệu. Kích thƣớc nguyên liệu lõi bắp trƣớc tiền xử lý với nấm mục trắng nhỏ hơn 5mm tạo cấu trúc xốp tốt cho nấm mục trắng sinh trƣởng. Tuy nhiên với kích thƣớc nguyên liệu lớn, hầu nhƣ nấm mục trắng chỉ tấn công làm thay đổi cấu trúc bề mặt ngoài của lõi bắp, còn phần cấu trúc bên trong không có sự thay đổi nhiều.
Để tăng hiệu quả đƣờng hóa, nguyên liệu cần đƣợc tiền xử lý cơ học giảm kích thƣớc trƣớc khi tiền xử lý với nấm mục trắng và đồng thời với kích thƣớc đó cũng tạo cấu trúc xốp tốt cho nấm phát triển.
Trang 50
CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Trong sản xuất bioethanol từ lignocelluose thì quá trình tiền xử lý nguyên liệu là cực kỳ quan trọng. Kết quả trên cho thấy, tiền xử lý lõi bắp bằng phƣơng pháp sinh học chƣa đạt đƣợc hiệu quả cao, lƣợng đƣờng đƣờng hóa khá thấp (với 20% cơ chất, lƣợng đƣờng thu đƣợc ~ 27 g/l, hiệu suất 22%), chƣa cải thiện đƣợc hiệu quả phản ứng enzyme cơ chất và thời gian xử lý khá dài (14 ngày).
Kết quả khảo sát cũng cho thấy, quá trình đƣờng hóa sử dụng viscozyme lƣợng
đƣờng thu đƣợc cao hơn hẳn, 4.9 g/l, 10% enzyme so với dùng enzyme bán tinh khiết là 3.5 g/l, 12% enzyme.
Do những hạn chế về mặt thiết bị và thời gian thí nghiệm nên đề tài chƣa mở rộng nghiên cứu thêm các hƣớng phát triển khác. Sau đây là những nội dung cần đƣợc nghiên cứu thêm:
Nghiên cứu tối ƣu các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh trƣởng và sinh tổng hợp hệ enzyme ligninases của Phanerochaete chrysosporium đến quá trình tiền xử lý lõi bắp nhƣ: kích thƣớc nguyên liệu, hàm lƣợng C thích hợp, các loại N khác ngoài N vô cơ nhƣ peptone hoặc cao nấm men, khảo sát độ ẩm, nhiệt độ thích hợp để nấm sinh trƣởng và tích lũy enzyme.
Nghiên cứu kết hợp phƣơng pháp tiền xử lý với phƣơng pháp khác.
Cải thiện năng suất sinh học của giống Phanerochaete chrysosporium.
Cải thiện và chọn lọc giống có khả năng tích lũy hoạt tính enzyme (ligninases, cellulases, hemicellulases) cao.
Nghiên cứu tối ƣu quá trình sản xuất và tinh sạch enzyme để giảm chi phí sản xuất.
Nghiên cứu khả năng sản xuất bioethanol theo phƣơng pháp đồng đƣờng hóa và đồng lên men, nâng cao hiệu quả sản xuất
Trang 51 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Anneli Nilsson.Control Of Fermentation Of Lignocellulosic Hydrolysates.
Badal C. Saha, 2004. Lignocellulose Biodegradation And Applications In Biotechnology. U.S. government work. American Chemical Society.
Berlin A, Balakshin M, Gilkes N, Kadla J, Maximenko V, Kubo S, Saddler JN, 2006.
Inhibition Of Cellulase, Xylanase And Β-Glucosidase Activities By Softwood Lignin Preparations. J Biotechnol 125:198–209
Carlos A. Cardona và Oscar J. Sanchez, 2007. Fuel Ethanol Production: Process
Design Trends and Integration Opportunities. Bioresource Technology; 98: 2415–
2457.
Castanon M, Wilke C.R. 1981. Effects Of The Surfactant Tween 80 On Enzymatic
Hydrolysis Of Newspaper. Biotechnol. Bioeng. 23:1365-72.
Charles E.Wyman, 1996. Handbook on Bioethanol: Product and Utilization. Taylor & Francis, p.119-285.
Clarence S. Yah, Sunny E. Iyuke, Emmanuel I. Unuabonah, Odelia Pillay, Chetty Vishanta và Samuel M. Tessa, 2010. Temperature Optimization For Bioethanol
Production From Corn Cobs Using Mixed Yeast Strains. OnLine Journal of Biological
Sciences; 10 (2): 103-108, 2010; ISSN 1608-4217.
Converse A.O, Matsuno R., Tanaka M., Taniguchi M. 1988. A Model For Enzyme Adsorption and Hydrolysis of Mycrocrystalline Cellulose With Slow Deactivation Of The Adsorbed Enzyme. Biotechnol. Bioeng. 32:38-45.
Galhaup, C., Wagner, H., Hinterstoisser, B. & Haltrich, D, 2002. Increased Production Of Laccase By The Wood Degrading Basidiomycetes Tramete Pubescens.
Enzyme and Microbial Technology 30, 529–536.
Gary J. Samuels, 2004. Trichoderma A Guide To Identification And Biology. Unit
States Deparment of Agriculture Agricultural Research service Systermatic Botany and Mycology Laboratory 304, B-011A Beltsville, MD 20705-2350, USA.
Trang 52
Potential Of Enzyme Recycle To Enhance The Efficiency Of An Integrated Wood To Ethanol Process. Bioethanol. Bioeng. 51:375-383.
Hans P.Blaschek, Thaddeus C. Ezeji. Science of Alternative Feedstocks.
Helle S.S., Duff S.J.B., Cooper D.G. 1993. Effect of Surfactants on Cellulose Hydrolysis. Biotechnol. Bioeng. 42:611-617.
Hetti Palonen, 2004. Role Of Lignin In The Enzymatic Hydrolysis Of Lignocellulose. VTT Biotechnology, p 11-39.
Hill, J., Nelson, E., Tilman, D., Polasky, S., and Tiffany, D., 2006. Environmental, Economic, And Energetic Costs And Benefits Of Biodiesel And Ethanol Biofuels. Proc.
Natl. Acad. Sci., 103,11206–11 210.
Huseyin Serdar Yucesu, Tolga Topgul, Can Cinar and Melih Okur, 2006. Effect Of Ethanol Gasoline Blends On Engine Performance And Exhaust Emissions In Different Compression Ratios. Applied Thermal Engineering. Vol 26, 2272-2278.
Huỳnh Ngọc Phƣơng Mai, 2010. Đánh giá khả năng phân hủy của nấm Phanerochaete chrysosporium đối với một số hợp chất hữu cơ khó phân hủy sinh học trong nước rỉ rác cũ. Trung Tâm Công nghệ và quản lý môi trƣờng.
Jared Bourke, 2006. Preparation and Properties of Natural, Demineralized, Pure, and
Doped Carbons from Biomass; Model of the Chemical Structure of Carbonized Charcoal. Master of science thesis, The university of Waikato, 2006. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Jia Ouyang, Zhenjiang Li, Xin Li, Hanjie ying, và Qiang Yong, 2009. Enhanced Enzymatic Conversation And Glucose Production Via Two-Step Enzymatic Hydrolysis Of Corncob Residue From Xylo-Oligosaccharides Producer’s Waste. Bioresources
4(4), 1586-1599.
Kaar W.E., Gutierrez C.V., Kinoshita C.M. 1998. Steam Explosion Of Sugarcane Bagasse For Conversion To Ethanol. Biomass and Bioenergy 14:277-287.
Keller FA, Hamillton TE, Nguyen QA, 2003. Microbial Pretreatment Of Biomass Potential For Reducing Severity Of Thermo-Chemical Biomass Pretreatment. Appl
Trang 53
Sustainable Feedstock For Bioethanol Production. Bioresource Technology; 88: 17–
25.
Maiorella, B.L., Blanch, H.W., Wilke, C.R., 1984. Economic Evaluation Of
Alternative Ethanol Fermentation Processes. Biotechnology and Bioengineering 26,
1003–1025.
Mats Galbe và Guido Zacchi, 2007. Pretreatment Of Lignocellulosic Materials For Efficient Bioethanol Production. Adv Biochem Engin/Biotechnol, 108: 41-65.
Michael J. Bradley và Brian M. Jones , 2002. Reducing Global Nox Emissions: Developing Advanced Energy And Transportation Technologies. Ambio Vol. 31 No.
2.
M. Asgher, M.J. Asad và R.L. Legge, 2006. Enhanced Lignin Peroxidase Synthesis By
Phanerochaete Chrysosporium In Solid State Bioprocessing Of A Lignocellulosic Substrate. World Journal of Microbiology & Biotechnology; 22: 449–453.
Md. Zahangir Alam, Mariatul F. Mansor và K. C. A. Jalal, 2009. Optimization Of Lignin Peroxidase Production And Stability By Phanerochaete Chrysosporium Using Sewage-Treatment-Plant Sludge As Substrate In A Stirred-Tank Bioreactor. Society
for Industrial Microbiology.
Mehdi Dashtban, Heidi Schraft, Wensheng Qin, 2009. Fungal Bioconversion of Lignocellulosic Residues; Opportunities & Perspectives. International Journal of
Biological Sciences; 5(6):578-595.
Mehdi Dashtban , Heidi Schraft, Tarannum A. Syed, Wensheng Qin, 2010. Fungal Biodegradation And Enzymatic Modification Of Lignin. Int J Biochem Mol
Biol;1(1):36-50.
Mohammad J. Taherzadeh và Keikhosro Karimi, 2008. Pretreatment Of Lignocellulosic Wastes To Improve Ethanol And Biogas Production: A Review. Int. J.
Mol. Sci., 9, 1621-1651.
Nguyễn Đức Lƣợng, 2001. Công Nghệ Sinh Học. Nhà xuất bản Đại học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.
Trang 54
hóa sinh học. Nhà xuất bản Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh.
Nguyễn Đức Lƣợng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết, 2006. Thí Nghiệm Công
Nghệ Sinh Học (tập 2) – Thí Nghiệm Vi Sinh Vật Học. NXB ĐHQG TP.HCM.
Nguyễn Thị Ngọc Bích, 2003. Kỹ thuật cellulose và giấy, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.
Park J.W., Takahata Y., Kajiuchi T., Akehata T. 1992. Effect Of Non-Ionic Surfactant (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
On Enzymatic Hydrolysis Of Used Newspaper. Biotechnol. Bioeng. 39:117-120.
Pascal Bonnarme, Juana Perez, và Thomas W. Jeffries., 1991. Chapter 16: Regulation
Of Ligninase Production In White-Rot Fungi. American Chemical Society.
Petia Petrova, Viara Ivanova, 2010. Perspectives For The Production Of Bioethanol From Lignocellulosic Materials. Biotechnol. & Biotechnol. EQ. 24/2010/SE
Phạm Thị Ánh Hồng, 2003. Kỹ thuật sinh hóa. Nhà xuất bản đại học Quốc gia
TP.HCM.
Rajagopalan Venkatadri và Robert L. Irvine, 1990. Effect Of Agitation On Ligninase Activity And Ligninase Production By Phanerochaete Chrysosporium. Applied And
Environmental Microbiology; p. 2684-2691 Vol. 56, No. 9.
Ratledge C, 1991. Yeast physiology – a micro-synopsis. Bioprocess Engineering.
6:195-203.
Rishi Gupta, Girija Mehta, Yogender Pal Khasa và Ramesh Chander Kuhad, 2010.
Fungal Delignification Of Lignocellulosic Biomass Improves The Saccharification Of Cellulosics. Biodegradation.
R. P. Chandra và cs, R. Bura, W. E.Mabee, A. Berlin, X. Pan J. N. Saddler, 2007.
Substrate Pretreatment: The Key to Effective Enzymatic Hydrolysis of Lignocellulosics?. Adv Biochem Engin/Biotechnol, 108: 67–93
Sewalt VJH, Glasser WG, Beauchemin KA, 1997. Lignin Impact on Fiber Degradation Reversal of Inhibition of Enzymatic Hydrolysis by Chemical Modification of Lignin and by Additives. J Agric Food Chem 45:1823–1828
Trang 55
Some Inducers On Activity Of Ligninolytic Enzymes From Corncob Cultures Of Phanerochaete Chrysosporium In Semi-Solid-State Conditions. Stability and
Stabilization of Biocatalysts.
Singh, D. & Chen, S., 2008. The White-Rot Fungus Phanerochaete Chrysosporium:Conditions For The Production Of Lignin-Degrading Enzymes.
Applied Microbiology & Biotechnology; 81:399–417.
Sun Y, Zhang JP, Yang G, Li ZH, 2007. Analysis Of Trace Elements In Corncob By
Microwave Digestion-ICP-AES. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi;27(7):1424-7.
Taherzadeh, M.J. 1999. Ethanol From Lignocellulose: Physiological Effects Of Inhibitors And Fermentation Strategies. Ph.D. thesis. Chalmers Univ, Göteborg,
Sweden.
Varga Eniko, 2003. Bioethanol Production: Pre-Treatment And Enzymatic Hydrolysis
Of Corn Stover. PH.D. Thesis. Budapest University Of Technology And Economics.
Vikas Singhal và V. S. Rathore, 2001. Effects of Zn2+ and Cu2+ on Growth, Lignin Degradation and Ligninolytic Enzymes in Phanrechaete chrysosporium. World
Journal of Microbiology & Biotechnology; 17: 235-240.
Yefu Chen, Boyu Dong, Weijun Qin, Dongguang Xiao, 2010. Xylose And Cellulose Fracxylose And Cellulose Fractionation From Corncob With Three Different Strategies And Separate Fermentation Of Them To Bioethanol. Bioresource
Technology, 101, 6994–6999. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
http://www.gso.gov.vn/default.aspx?tabid=430&idmid=3.
http://www.iogen.ca/
Trang 56
PHỤ LỤC
1. Đƣờng cong chuẩn Phanerochaete chrysosporium
Đƣờng cong chuẩn biểu diễn mật độ tế bào (số tế bào/ml) Phanerochaete chrysosporium theo độ hấp thu ở bƣớc song 650nm.
Bảng 1: Tƣơng quan giữa số tế bào/ml và độ hấp thu Độ hấp thu A Số tế bào/ml 0.50 7.65x106 0.66 1.67x107 0.70 1.89x107 0.75 2.00x107 Hình 1: Đƣờng cong chuẩn 2. Đƣờng chuẩn đƣờng tổng số hòa tan
Bảng 2: Tƣơng quan giữa nồng độ đƣờng và độ hấp thu Độ hấp thu A Nồng độ đƣờng (µg/ml) 0.111 10.40 0.204 19.22 0.327 30.82 0.425 40.07 0.532 50.11 y = 2E-08x + 0.3488 R² = 0.9862 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8
0.00E+00 5.00E+06 1.00E+07 1.50E+07 2.00E+07 2.50E+07
Đƣờng cong chuẩn
OD
Trang 57
Hình 2: Đƣờng chuẩn đƣờng tổng số hòa tan 3. Hệ số glucose
Bảng 3: Tƣơng quan giữa nồng độ đƣờng và độ hấp thu Độ hấp thu AG-Aw Nồng độ đƣờng (mg/ml) 0.111 0.1 0.216 0.2 0.309 0.3 0.441 0.4 0.518 0.5
Cách tính hệ số glucose F theo Nguyễn Đức Lượng và Cao Cường, 2003. Hệ số glucose tính toán t ừ excel à 0.9581.
4. Các công thức tính Hiệu suất chuyển hóa:
Đườ ổ
ổ à
Xem tổng cellulose và hemicellulose chiếm 60% phần khối lƣợng nguyên liệu khô. y = 0.0106x + 0.0003 R² = 0.9992 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 10 20 30 40 50 60
Đƣờng chuẩn đƣờng tổng số hòa tan
OD