Xác định hoạt tính cellulases theo phƣơng pháp CMCase
Nguyên tắc
Phƣơng pháp này dựa trên sự thủy giải CMC (sodium carboxymetyl cellulase) bằng enzym ở pH 5.0 và 400C. Sau phản ứng thủy phân sẽ tạo ra một lƣợng đƣờng khử, đƣờng khử sẽ phản ứng với axit 3,5-dinitrosalicylic và đƣợc xác định bằng máy đo mật độ quang ở bƣớc sóng 540nm.
Cách thực hiện
Phản ứng với enzym
- Hút 1 mL dung dịch mẫu vào ống nghiệm và để ổn định nhiệt độ ở 400C trong 5 phút. Cũng để dung dịch cơ chất ổn định ở nhiệt độ này trong 5 phút.
- Thêm 1 mL dung dịch cơ chất vào ống nghiệm đựng dung dịch mẫu và lắc đều.
- Để phản ứng xảy ra trong khoảng chính xác 400
Trang 29
- Thêm vào 4 mL dung dịch lactose – DNS, lắc đều thật kỹ để ngừng phản ứng enzym.
- Để tránh sự bốc hơi nƣớc, dùng một miếng nilon hay parfilm dán lấy miệng ống nghiệm và đặt ống nghiệm vào nƣớc sôi trong 15 phút.
- Đƣa ống nghiệm về nhiệt độ phòng bằng cách đặt ống nghiệm vào một nồi nƣớc lạnh.
- Đo độ hấp thu OD ở bƣớc sóng 540 nm. Dùng nƣớc cất làm mẫu đối chứng. (AT)
Phản ứng thử không
- Hút 1 mL dung dịch mẫu vào ống nghiệm và để ổn định nhiệt độ ở 400C trong 5 phút. Cũng để dung dịch cơ chất ổn định ở nhiệt độ này trong 5 phút.
- Thêm vào 4 mL dung dịch lactose DNS, lắc đều.
- Thêm 1 mL dung dịch cơ chất vào ống nghiệm đựng dung dịch mẫu và lắc đều.
- Để tránh sự bốc hơi nƣớc, dùng một miếng nilon hay parafilm dán lấy miệng ống nghiệm và đặt ống nghiệm vào nƣớc sôi trong 15 phút.
- Đƣa ống nghiệm về nhiệt độ phòng bằng cách đặt ống nghiệm vào nồi nƣớc lạnh.
- Đo độ hấp thu OD ở bƣớc sóng 540 nm. Dùng nƣớc cất làm mẫu đối chứng. (AB)
Phản ứng của các dung dịch đƣờng glucose chuẩn và nƣớc cất
- Hút lần lƣợt 1 mL các dung dịch đƣờng glucose chuẩn vào các ống nghiệm.
- Thêm vào 1 mL dung dịch cơ chất và lắc đều. - Thêm vào 4 mL dung dịch lactose DNS, lắc đều.
- Để tránh sự bốc hơi nƣớc, dùng một miếng nilon hay parafilm dán lấy miệng ống nghiệm và đặt ống nghiệm vào nƣớc sôi trong 15 phút.
- Đƣa ống nghiệm về nhiệt độ phòng bằng cách đặt ống nghiệm vào nồi nƣớc lạnh.
- Đo độ hấp thu OD ở bƣớc sóng 540 nm. Dùng nƣớc cất làm mẫu đối chứng. (AG)
Trang 30
- Đối với nƣớc cất: làm tƣơng tự nhƣ trên. Thay dung dịch glucose chuẩn bằng nƣớc cất. Đo độ hấp thu ở bƣớc sóng 540 nm. (Aw).
Định nghĩa:
Một đơn vị hoạt tính CMCase đƣợc định nghĩa là lƣợng enzym cần thiết để giải phóng ra đƣờng khử (glusoce) ở tốc độ µmol/phút dƣới các điều kiện thực nghiệm.
Tính toán
Tính hệ số glucose
- Hiệu chuẩn độ hấp thu OD của dung dịch đƣờng glucose chuẩn bằng cách: AG – AW.
- Đối với mỗi nồng độ pha loãng, dựng đƣờng biểu diễn sự biến thiên sự biến giữa OD và nồng độ glucose (mg/mL).
- Chia nồng độ (mg/mL) cho độ hấp thu OD của mỗi dung dịch đƣờng chuẩn để thu đƣợc giá trị hệ số glucose (mg/mL), tính giá trị hệ số trung bình. - Hệ số glucose đƣợc tính bằng công thức:
Trong đó:
F: hệ số glucose
CG: nồng độ dung dịch glucose chuẩn (mg/mL) AG: độ hấp thu OD của dung dịch glucose chuẩn AW: độ hấp thu OD của phản ứng với nƣớc cất. Xác định hoạt tính enzym
Trong đó: AT: độ hấp thu OD của dung dịch enzym AB: độ hấp thu OD của phản ứng F: hệ số glucose (mg/mL) CG (mg/mL) F = AG - AW 1000 1 1 1 CMCase (u/g) = (AT – AB) x F x x x x 180 10 phút 1 mL C CG (mg/mL) F = AG - AW
Trang 31
1000: chuyển từ mg sang µg
180: trọng lƣợng phân tử glucose, đổi từ µg sang µmol 10 phút: thời gian phản ứng
C: nồng độ dung dịch mẫu (g/mL).