Nguyên tắc
Sự định phân này căn bản dựa trên phản ứng màu đặc trƣng cho đƣờng và nhiều chất hữu cơ với sự hiện diện của axit sulfuric (H2SO4). Để cho kết quả này chính xác tùy thuộc vào:
- Độ sạch dụng cụ
- Độ tinh khiết của thuốc thử (H2SO4)
- Nhiệt độ phải cố định trong suốt thời gian đun.
Hóa chất.
- Dung dịch H2SO4 đậm đặc
- Dung dịch đƣờng chuẩn sucrose 0,1% ( cho 0,1 g glucose đã sấy khô hòa tan trong 100 mL nƣớc cất).
- Phenol 5% (5g phenol rắn trong 100 ml nƣớc cất)
Cách tiến hành
Hút 1 ml dịch đƣờng cần định lƣợng cho vào ống nghiệm rồi cho thêm 1 ml phenol 5%. Sau đó cho chính xác 5 ml H2SO4 đậm đặc vào ống nghiệm (không để giây acid vào thành ống). Để 10 phút rồi lắc, giữ trên nồi cách thủy 10 – 20 phút ở 25 – 30 oC để hiện màu.
Xây dựng đồ thị chuẩn: lấy bảy bình định mức 100 ml cho vào đó theo thứ tự: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ml dung dịch sucrose mẫu 0.1%, cho nƣớc đến vạch định mức. Từ mỗi bình lấy ra 1 ml dung dịch đã pha loãng cho vào các ống nghiệm rồi nhuộm màu bằng phenol và H2SO4 nhƣ trên. Trong mỗi ống nghiệm sẽ chứa tƣơng ứng 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 µg sucrose. Thay 1 ml dịch đƣờng bằng 1 ml nƣớc cất dùng làm ống thử không.
Trang 32
Màu bền vững sau vài giờ. Xác định cƣờng độ màu bằng máy so màu VIS ở bƣớc sóng 490 nm.
Kết quả
Trị số mật độ quang (OD) của những ống đối chứng sau khi đã trừ trị số của ống thử không sẽ xác định đƣợc đƣờng cong mẫu. Với dung dịch đƣờng cần định nồng độ, ta cũng trừ đi trị số ống thử không rồi chiếu vào đƣờng cong mẫu để suy ra nồng độ x, từ đó tính ra phần trăm lƣợng đƣờng có trong mẫu.
Trang 33
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
4.1. Khảo sát thời gian tiền xử lý
Lõi bắp chứa chủ yếu là cellulose, với hàm lƣợng cellulose (30-45%) thuộc nhóm có hàm lƣợng cellulose cao trong các phế phẩm nông nghiệp. Qua đó, cho thấy lõi bắp cũng là một nguồn nguyên liệu tiềm năng cho quá trình sản xuất bioethanol.
Hàm lƣợng hemicellulose chiếm thành phần nhiều thứ hai trong lõi bắp (35- 40%). Nó tồn tại ở trạng thái vô định hình, dễ thấm nƣớc, cản trở sự tiếp xúc của enzyme với cellulose. Nên đây là thành phần cần loại bỏ. Tuy với hàm lƣợng hemicellulose khá cao nhƣng bản thân nó là một loại polysaccharide, cũng là một nguồn nguyên liệu có thể sản xuất bioethanol với thành phần chứa nhiều đƣờng 5. Nên ta có thể tận dụng để sản xuất bioethanol thông qua các loại nấm men lên men đƣờng 5 (nhƣ Pichia stipitis).
Hàm lƣợng lignin trong lõi bắp (10-20%) tƣơng đối thấp so với các loại phế phẩm nông nghiệp khác. Đây là thành phần cần loại bỏ để tăng khả năng tiếp xúc pha của cellulose với enzyme trong quá trình đƣờng hóa.
Kết quả các mẫu thí nghiệm với thời gian xử lý khác nhau đƣợc thể hiện trong bảng 4.1 và hình 4.1, 4.2.
Trang 34
Bảng 4.1: Kết quả tiền xử lý lõi bắp với nấm mục trắng theo thời gian Mẫu Ngày Đƣờng tổng (g/l) Hiệu suất chuyển hóa (%)
1 0 1.23 4.11 2 7 0.75 2.51 3 10 1.10 3.66 4 14 2.92 9.72 5 16 3.44 11.46 6 18 4.29 14.29 7 21 4.53 15.11 8 25 5.10 16.99
Sau thời gian tiền xử lý với nấm mục trắng, lõi bắp có sự chuyển màu từ màu vàng sang nâu đậm là do sự tạo thành các hợp chất phenol, sản phẩm thủy phân lignin. Cấu trúc lignocellulose của lõi bắp thay đổi một phần do cellulose, hemicellulose, lignin bị thủy phân. Cellulose không còn đƣợc bảo vệ hoàn toàn bởi hemicellulose và lignin, do đó enzyme tiếp xúc và thủy phân cellulose dễ dàng hơn.
Qua đồ thị hình 4.2 ta thấy thời gian xử lý càng dài, lƣợng đƣờng càng tăng. So với mẫu 0 chƣa qua xử lý với nấm mục trắng thì các mẫu xử lý ở thời điểm trƣớc 14 ngày có lƣợng đƣờng thấp hơn do thời gian đầu nấm mục trắng sử dụng lƣợng đƣờng glucose trong môi trƣờng ban đầu để tăng sinh và một phần tạo enzyme ligninases. Mẫu chƣa qua xử lý có lƣợng đƣờng cao hơn (1.23 g/l so với 0.75 và 1.1 g/l ở mẫu xử lý 7 ngày và 10 ngày) là do lƣợng đƣờng hòa tan sẵn có trong lõi bắp và một phần cellulose vô định hình dễ bị tấn công bởi enzyme.
Lƣợng đƣờng thu đƣợc sau 14 – 18 ngày cao gấp 3 lần so với sau 10 ngày cho thấy nấm mục trắng sinh tổng hợp enzyme ligninases cao sau 10 ngày. Sau 14 ngày lƣợng đƣờng tăng chậm cho thấy hoạt tính ligninases giảm dần (hiệu suất chuyển hóa tăng chậm).
Trang 35
(a)
(b)
Hình 4.2: Đồ thị khảo sát thời gian tiền xử lý lõi bắp với nấm mục trắng. Thời gian xử lý càng dài lƣợng đƣờng càng tăng đồng nghĩa với việc enzyme cellulases càng dễ thủy phân cellulose nhƣng sẽ không có lợi về mặt kinh tế. Do đó
0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 0 5 10 15 20 25 30
Khảo sát thời gian tiền xử lý
Thời gian (ngày) Đƣờng tổng (g/l) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0 5 10 15 20 25 30
Khảo sát thời gian tiền xử lý
Thời gian (ngày) Hiệu suất (%)
Trang 36
thời gian tiền xử lý lõi bắp với nấm mục trắng tốt nhất là 14 ngày. Tuy nhiên do điều kiện thí nghiệm không cho phép, các thí nghiệm sau mẫu lõi bắp đƣợc tiền xử lý trong thời gian 10 ngày.