PH NG PHÁP NGHIÊN CU 31

Các b c ti n hành nghiên c u g m:

B c 1. L p danh sách ch ng VK lao c n nghiên c u. C p nh p các thông tin ti n s đi u tr b nh c a b nh nhân và k t qu kháng sinh đ c a ch ng VK gây b nh. Chia m u nghiên c u thành hai nhóm.

 Nhóm 1(N1) g m 1390 ch ng VK lao phân l p t b nh nhân lao ph i AFB (+) m i.

 Nhóm 2(N2) g m 185 ch ng VK lao phân l p t b nh nhân lao ph i AFB (+) đã đi u tr .

B c 2. Chu n b ch ng VK lao. L y ch ng vi khu n t t b o qu n -72⁰C và s p x p theo danh sách đã trích l c.

B c 3. Tách tri t DNA c a ch ng VK lao theo quy trình chu n c a Vi n nghiên c u S c kh e và Môi tr ng Hà Lan – RIVM.

B c 4. Th c hi n ph n ng PCR nhân gen vùng DR c a VK lao

B c 5. Lai s n phâm PCR v i màng lai Biodyne C đã có g n các trình t oligonucleotide (xem ph l c 3).

B c 6. Phát hi n tín hi u lai b ng ph n ng quang hóa s d ng ECL. Tín hi u lai đ c bi u hi n trên phim X-ray (xem ph l c 4).

B c 7. Nh n di n tín hi u lai, s hóa và c p nh p vào máy tính. So sánh v i c s d li u SpolBD4 đ có k t qu ki u gen M.tuberculosis t ng ng.

Lu n v n th c s sinh h c Khi u Th Thúy Ng c ---

32

B c 8. X lý và phân tích s li u: Xác đ nh t l phân b và phân tích m i liên quan đ n tính kháng thu c lao c a M.tuberculosis ki u gen Beijing.

Hình 16. S đ nghiên c u

Thu th p ch ng M.tuberculosis

Nhóm 1:1390 ch ng M.tuberculosis

t BN lao ph i AFB (+) m i ^{Nhóm 1:185 ch ng} _{t BN lao ph i AFB (+)} ^{M.tuberculosis}đã đi u tr

Tách DNA M.tuberculosis Nhân vùng gen DR b ng c p m i Dra và Drb Lai s n ph m PCR v i màng Biodyne C Phát hi n tín hi u lai b ng ECL trên phim X-ray

Nh n di n tín hi u lai, so sánh và

phân lo i ki u gen M.tuberculosis

Xác đnh phân b

Lu n v n th c s sinh h c Khi u Th Thúy Ng c ---

33

2.2.2. Ph ng pháp Spoligotyping - spacer oligonucleotide typing

Ph ng pháp spoligotyping d a trên c s c a k thu t lai phân t , b ng cách cho lai các s n ph m PCR c a vùng l p l i tr c ti p (DR) c a vi khu n lao v i các trình t oligonucleotid đ c tr ng cho vùng này đ c c đ nh trên màng lai. Tín hi u lai khác nhau cho phép phân chia các ch ng

M.tuberculosis thành các nhóm khác nhau [47].

Các b c ti n hành k thu t:

 Chu n b v t li u

L y hai ng khu n l c VK lao cho vào tuýp eppendorf ch a 250 µl 1×TE. Gi t vi khu n 80 º C/60 phút. Ly tâm 13000 rpm/2 phút. Ch t b n c n i. R a hai l n v i 500µl dung d ch 150 mM NaCl. Ch t b n c n i r i cho thêm 400 µl 1×TE.

Các dung dich hóa ch t đ c pha theo công th c trình bày ph l c. Màng lai Biodyne C đã đ c g n các oligonucleotide.

M u ch ng d ng là hai ch ng M. tuberculosis H37Rv và M.bovis P3. M u ch ng âm là n c c t tinh khi t.

 Tách tri t DNA

tách chi t DNA VK lao cho nghiên c u này chúng tôi đã áp d ng ph ng pháp tách chi t DNA theo quy trình chu n c a Vi n nghiên c u S c kh e và Môi tr ng Hà Lan – RIVM theo các b c sau [60]:

- Tuýp Eppendorf ch a VK lao trong 400 µl 1×TE trên đ c b sung 50l 10 mg/ml lysozyme, l c k và ít nh t 1 gi 37°C.

Lu n v n th c s sinh h c Khi u Th Thúy Ng c ---

34 - Thêm 100 l 5 M NaCl.

- Thêm 100 l CTAB/NaCl . Dung d ch này c n gi 65°C tr c khi dùng . L c k r i 65°C/10 phút

- Thêm 750 l Chloroform/isoamyl alcohol (24:1), L c 10 giây và ly tâm 12000 v/ 5 phút nhi t đ phòng (RT) - Hút h t d ch n i sang tuýp s ch khác. - Thêm 450 l isopropanol. - t vào đá l nh kho ng 10 phút . - Ly tâm 15 phút nhi t đ phòng. - Hút b n c n i , r a c n b ng 1 ml 70% ethanol , ly tâm 12000 v/ 5 phút Hút b n c n i , làm khô c n.

- Thêm 20 l of 1xTE . B o qu n DNA 4°C đ n khi s d ng

 Th c hi n ph n ng PCR nhân gen vùng DR c a VK lao

B ng 2. Thành ph n ph n ng PCR nhân gen vùng DR c a VK lao

Thành ph n N ng đ cho ph n ng ^{Th tích cho 1 ph n ng} (µl) Dra (g n biotin ) 0,40 M 4,00 Drb 0,40 M 4,00 dNTPs 0,20 mM 4,00 MgCl₂ 1,50 mM 1,50 Tag 0,75 U/ l 0,15 Buffer 10X 1,00 X 5,00 N c c t tinh khi t 29,35

Lu n v n th c s sinh h c Khi u Th Thúy Ng c --- 35 DNA m u 30,00 ng/ l 2,00 T ng th tích 50,00 Ch ng trình ch y PCR: B c 1 96⁰C 3 phút B c 2 96⁰C 1 phút 25 chu k 55⁰C 1 phút 72⁰C 30 giây B c 3 72⁰C 5 phút Gi 4⁰C

Sau khi nhân gen, s n ph m PCR s đ c đi n di trên gel agarose 1% trong th i gian 30 phút đ ki m tra k t qu c a ph n ng PCR c ng nh ki m tra n ng đ s n ph m có đ đ th c hi n ph n ng lai hay không.

 Lai s n ph m PCR v i màng lai

Chu n b hóa ch t cho vào b n nhi t nh sau:

- 250 ml 2xSSPE/0,1% SDS đ t 60⁰C - 500 ml 2xSSPE/0,5% SDS đ t 60⁰C - 500 ml 2xSSPE/0,5% SDS đ t 42⁰C

Lu n v n th c s sinh h c Khi u Th Thúy Ng c ---

36

Hình 17. Các b c ti n hành k thu t Spoligotyping[47]

- Cho 30 l s n ph m PCR vào 150 l 2xSSPE/0,1% SDS

- Bi n tính DNA: đ t 99⁰C trong 10 phút, l y ra đ t ngay vào khay đá - R a màng lai: màng lai đ c gi trong EDTA nhi t đ 4⁰C, sau khi l y

ra c n r a v i 250 ml 2xSSPE/0,1% SDS trong 5 phút 60⁰C.

- t màng lai vào trong miniblotter, sau đó hút b b t khí trong các rãnh. - DNA sau khi bi n tính đ c b m vào các rãnh đ th c hi n ph n ng lai

60⁰C trong 60 phút.

- Sau khi k t thúc ph n ng lai, hút b DNA trong các rãnh. R a màng v i 250 ml 2xSSPE/0,5% SDS 2 l n, m i l n 10 phút 60⁰C.

- Cho 2,5 l Streptavidin-peroxidase vào 10ml 2xSSPE/0,5% SDS, màng v i dung d ch này trong kho ng 45-60 phút 42⁰C.

- R a màng 2 l n, m i l n v i 250ml 2xSSPE/0,5% SDS trong 10 p 42⁰C. - R a màng 2 l n, m i l n v i 250ml 2xSSPE trong 5 phút nhi t đ phòng - màng trong 1 phút v i 20 ml ECL đ phát hi n tín hi u lai. L u ý đ

Lu n v n th c s sinh h c Khi u Th Thúy Ng c ---

37

- t màng trong m t t m nilon m ng, bên trên đ t phim X-ray. T t c đ t trong h p phim (cassette) trong vòng 2 gi . Thao tác này th c hi n trong bu ng t i.

- Phim sau khi đ c tráng v i dung d ch hi n phim (devoloper) và dung d ch c đnh (fixer) c a hãng FUJI nh m phát hi n các tín hi u lai trên phim X-ray.

- N u tín hi u lai quá y u hay quá m nh có th l i v i m t t m phim khác,

đ ng th i t ng hay gi m th i gian phim.

 R a màng sau khi lai

- B c này đ c th c hi n nh m lo i b DNA lai bám trên màng đ dùng cho l n lai ti p theo.

- R a màng 2 l n, m i l n v i 250 ml 1%SDS trong 30 phút 80⁰C.

- R a màng v i 250 ml 20mM EDTA trong 15 phút nhi t đ phòng

- Màng sau khi r a đ c gi trong 20mM EDTA 4⁰C cho đ n khi s d ng.

- M i màng có th tái s d ng 12 l n

 c k t qu

Tín hi u lai đ c s hóa và c p nh p vào máy tính b ng ch ng trình Microsoft Excel v i 2 cách: nh p mã nh phân (binary code) ho c mã th p phân (octal code). So sánh v i c s d li u SpolBD4 đ có k t qu ki u gen

Lu n v n th c s sinh h c Khi u Th Thúy Ng c ---

38

Hình 18. Phòng Sinh h c Phân t - Khoa Vi sinh, B nh vi n Ph i T , n i th c hi n k thu t spoligotyping phân lo i M.tuberculosis

2.2.4. X lý và phân tích s li u

Nghiên c u đã s d ng ch ng trình EpiData phiên b n 3.1 đ x lý và phân tích s li u. Các d ki n đ c nh p hai l n đ c l p và s d ng file check

đ ki m soát l i nh m h n ch sai sót m c ph i trong quá trình c p nh p vào máy tính.

ki m tra đ tin c y và đánh giá m i liên quan c a các bi n s , nghiên c u đã s d ng các thu t toán th ng kê đ tính các giá tr P (m c ý ngh a - probability value), OR (t su t chênh – odd ratio) và 95% CI ( c l ng kho ng tin c y – confident interval).

Lu n v n th c s sinh h c Khi u Th Thúy Ng c ---

39

CH NG III: K T QU NGHIÊN C U

3.1. PHÂN B CÁC KI U GEN C A M.TUBERCULOSIS

3.1.1. Các ki u gen c a M.tuberculosisđ c phân lo i b ng k thu t Spoligotyping Spoligotyping

K t qu Spoligotyping thu đ c nh ng phim có hình nh nh sau:Cho

Ch ng âm

Hình 19 . K t qu Spoligotyping c a M.tuberculosis

Tín hi u lai đ c th hi n b ng nh ng ô màu đen. M i ch m đen t ng ng v i m t trình t đ m (spacer). T i nh ng v trí không có spacer s không có tín hi u lai, do đó s không có nh ng ch m đen mà s là nh ng kho ng tr ng. Phim đ c đ c t trái sang ph i. Hai ch ng đ c s d ng làm m u ch ng d ng là H37Rv và BCG P3, đ ng th i m t m u ch ng âm là n c c t cho phép ki m soát tr ng h p d ng tính gi c ng nh ki m tra s nhi m chéo gi a các rãnh.

Lu n v n th c s sinh h c Khi u Th Thúy Ng c ---

40

K t qu Spoligotyping đ c nh p vào máy tính b ng ch ng trình Excel theo 2 cách: mã nh phân (binary code) ho c mã th p phân (octal code).

Mã nh phân dùng s 1 t ng ng v i m t n t đen, s 0 t ng ng v i n t tr ng. Ba s li n nhau c a mã nh phân s đ c chuy n đ i thành m t s c a mã th p phân. Thông th ng k t qu đ c đ c theo mã nh phân.

T ng s m u đ c kh o sát b ng k thu t spoligotyping c a đ tài này là 1575 m u, k t qu ki u gen M.tuberculosis đ c trình bày b ng sau:

B ng 3. Các ki u gen M.tuberculosis đ c phân lo i b ng k thu t spoligotyping S TT Nhóm Ki u gen N1(n=1390) N2 (n=185) T ng s n % n % n % 1 BEIJING 458 32,9 96 51,9 554 35,2 2 EAI 123 8,8 9 4,9 132 8,4 3 EAI1_SOM 16 1,2 1 0,5 17 1,1 4 EAI2_MANILLA 17 1,2 2 1,1 19 1,2 5 EAI2_NTB 5 0,4 3 1,6 8 0,5 6 EAI4_VNM 177 12,7 13 7,0 190 12,1 7 EAI5 308 22,2 34 18,4 342 21,7 8 H1 3 0,2 1 0,5 4 0,3