Trong nh ng n m g n đây, v i s phát tri n c a công ngh sinh h c, đ c bi t trong l nh v c sinh h c phân t đã cho phép ng d ng nhi u k thu t ti n ti n vào trong ch n đoán nh m thu đ c k t qu xét nghi m m t cách nhanh chóng và chính xác..
a. K thu t PCR - Polymerase Chain Reaction:
PCR là ph n ng chu i trùng h p nh enzyme DNA-polymerase do Karl Mullis phát minh n m 1983. Th c ch t đây là m t ph ng pháp t o dòng in vitro nh m m c đích thu nh n m t l ng l n b n sao c a m t trình t xác
đnh. Trong th c nghi m, s d ng đo n m i có kh n ng b t c p b sung v i m t đ u c a m ch khuôn và DNA polymerase s n i dài m i đ hình thành m ch m i. Các đo n DNA m i l i đ c s d ng làm khuôn, sau m t s chu k thì s l ng đo n DNA đ c nhân lên theo c p s nhân. M t gen trong m t th i gian ng n có th đ c nhân lên hàng tri u l n [5].
.
Hình 11. K t qu đi n di s n phâm PCR cho ch n đoán xác đ nh VK lao có kích th c 249 bp.
Lu n v n th c s sinh h c Khi u Th Thúy Ng c ---
21
K thu t PCR đ c s d ng trong ch n đoán lao v i đo n m i đ c tr ng
đ c thi t k cho s phát hi n trình t IS 6110 đ c hi u đ i v i VK lao. ây là ph ng pháp cho k t qu nhanh v i đ đ c hi u cao tuy nhiên đ
nh y th c t l i th p h n so v i k thu t nuôi c y do nhi u y u t c ch ph n ng PCR có trong m u xét nghi m ho c do quá trình x lý, tách tri t đã làm m t đi khá nhi u DNA trong các m u b nh ph m v n đã có ít vi khu n lao.
b. K thu t Real-time PCR
Real-time PCR là m t k thu t d a trên PCR dùng đ nhân gen m c tiêu và phân tích s n ph m t o thành trong m t h th ng kín. S n ph m PCR t o ra sau m i chu k đ c theo dõi b ng s tích l y các tính hi u c a ch t màu hu nh quang, đi u này cho phép tính toán m t cách khá chính xác l ng DNA đích đ u tiên đ a vào ph n ng, thêm vào đó rút ng n đ c th i gian c a ph n ng. K t qu c a k thu t đ c phân tích b ng ph n m m trên h th ng máy tính, đ m b o tính khách quan và m c đ chính xác cao.
Do kh n ng theo dõi và phát hi n xuyên su t quá trình ph n ng, toàn b đ u đ c th c hi n b ng máy, k t qu đ c đ c b ng sensor có đ nh y cao, nên k thu t real – time PCR r t nh y, có th phát hi n ra m t l ng DNA/RNA r t th p (g i là giá tr d ng tính d i ng ng) mà k thu t PCR thông th ng không th phát hi n đ c (do gi i h n c a vi c đ c k t qu đi n di b ng m t thu ng) [5].
Hi n nay k thu t này đ c s d ng r t r ng rãi trong ch n đoán đnh tính và đ nh l ng các tác nhân sinh h c gây b nh.
Lu n v n th c s sinh h c Khi u Th Thúy Ng c ---
22
c. K thu t xác đnh trình t nucleotide
Nguyên t c c a k thu t d a trên vi c s d ng dideoxynucleotide có
đánh d u hu nh quang đ làm ng ng các m ch đ n DNA đang đ c t ng h p m t cách ng u nhiên. Enzyme DNA-polymerase xúc tác g n các nucleotide vào m ch đ n DNA đang t ng h p v trí 3’-OH, khi g p ddNTP (không có nhóm 3’- OH) thì ph n ng t ng h p b ng ng l i. K t qu ph n ng t ng h p nên các đo n DNA dài ng n khác nhau 1 nucleotide, có th phân tách nh
đi n di trên gel polyacrylamide, phát hi n các dNTP đã đánh d u nh tia laze [2].
Hình 12. Trình t gen M.tuberculosis có kích th c kho ng 4,4 Mbp[57].
Sau khi gi i trình t đo n gen đích ta s so sánh tr t t s p x p các nucleotide trên m u xét nghi m v i tr t t nucleotide chu n c a vi khu n gây b nh đ bi t đ c các v trí sai l ch, qua đó xác đ nh đ c chính xác loài vi khu n gây b nh c ng nh xác đ nh đ t bi n các gen có liên quan đ n tính kháng thu c t ng ng.
Ph ng pháp này có u đi m là đ nh y và đ đ c hi u cao, th i gian cho k t qu nhanh nh ng đòi h i trang thi t b máy móc hi n đ i, t n kém và c n nhân l c có trình đ chuyên sâu.
Lu n v n th c s sinh h c Khi u Th Thúy Ng c ---
23
1.4. M.TUBERCULOSIS KI U GEN BEIJING 1.4.1. nh ngh a
