Spoligotyping là m t trong các k thu t đ c s d ng nhi u nh t trong phân lo i ch ng M.tuberculosis. Ph ng pháp d a trên ph n ng chu i polymerase (PCR) đ xác đnh các trình t ng n l p l i tr c ti p (DR) dài 36 bp xen gi a các đo n đ m không l p l i kích th c 35-41bp. S có m t ho c thi u h t các trình t này đ c xác đnh b ng lai ghép s n ph m PCR v i 43 oligonucleotide t ng h p t các trình t đ m c a M.tuberculosis H37Rv. Spoligotyping có th phân bi t đ c các ch ng thu c nhóm M.tuberculosis
d a trên s m t ho c hi n di n các DR đ c phân tích, so sánh v i d li u spoligotyping qu c t SpolDB4. Kh n ng m t các đo n DR có th x y ra nhi u l n, đ c l p các ch ng, d n đ n s ti n hóa, xu t hi n các ki u spoligotype [26].
Phiên b n SpolDB4 đ c công b chính th c tháng 3/2006 áp d ng cho phân lo i, phân b di truy n và d ch t h c VK lao. C s d li u SpolDB4 g m 1.939 ki u spoligotypes thu nh n t 122 qu c gia v i t ng c ng 39.295 ch ng VK lao. Các spoligotypes đ c đ t tên d a theo các ki u m t đo n DR đ c tr ng và vùng phân b ch y u [18].
Lu n v n th c s sinh h c Khi u Th Thúy Ng c ---
24
B c đ u tiên c a k thu t này là khu ch đ i các vùng DR b ng cách th c hi n ph n ng PCR đ i v i DNA c a ch ng M.tuberculosis v i các đo n m i đ c tr ng sau:
M i xu i Dra : 5’- Biotin - GGTTTTGGGTCTGACGAC – 3’ M i ng c Drb : 5'- CCG AGA GGG GAC GGA AAC - 3'
Hinh 13 . Các vùng DR trên b gen M.tuberculosis [48].
Màng lai s đ c g n các trình t oligonucleotide song song v i nhau. Các s n ph m PCR s đ c lai v i các oligonucleotide này. Các khe (slot) ch a DNA s đ c đ t vuông góc v i các đ ng oligonucleotide [2].
Sau khi lai xong màng lai s đ c v i Streptavidine-peroxidase. Streptavidine-peroxidase s b t c p v i Biotin. Tín hi u lai s đ c phát hi n b ng ph n ng quang hóa v i dung d ch ECL (enhanced chemiluminescene) và các tín hi u lai này s đ c ghi nh n trên phim X-ray. So sánh tín hi u lai v i c s d li u SpolBD4 s cho ta k t qu phân lo i spoligotypes c a các ch ng M.tuberculosis.
Lu n v n th c s sinh h c Khi u Th Thúy Ng c ---
25
Hình 14. Nguyên t c phát tín hi u lai b ng Streptavidine-peroxidase
H n ch l n nh t c a k thu t spoligotyping là kh n ng phân lo i th p trong c ng đ ng có nhi u ch ng Beijing nh Nh t B n, Hàn Qu c, do ph ng pháp này không có kh n ng phân chia các ch ng M.tuberculosis ki u gen Beijing thành nh ng nhóm nh h n. Tuy nhiên u đi m c a k thu t là có th th c hi n đ c v i l ng DNA ít h n nhi u so v i các ph ng pháp khác, không c n tinh khi t DNA. th c hi n tr c ti p trên b nh ph m, m nh c t sinh thi t ho c t chính tiêu b n nhu m Ziehl – Neelsen[14]. Trong các nghiên c u kh o sát, thông th ng các ch ng VK lao đ c đnh danh nhanh b ng k thu t spoligotyping tr c khi ti n hành v i các ph ng pháp ti p theo.