Vào đ u th p niên 90, m t ch ng Mycobacterium tuberculosis kháng đa thu c đ c phát hi n New York, kí hi u là W đã gây ra s bùng n d ch b nh lao v i hàng lo t ng i ch t các vùng khác nhau c a n c M [51]. N m 1995, r t nhi u ch ng Mycobacterium tuberculosis B c Kinh, Trung Qu c c ng đ c báo cáo có liên quan đ n b nh lao kháng đa thu c và đ c
đ t tên là ch ng M.tuberculosis ki u gen Beijing. Các nghiên c u cho th y ch ng W chính là m t nhánh nh c a ch ng M.tuberculosis ki u gen Beijing, sau này còn đ c tìm th y nhi u vùng khác nhau trên th gi i [17, 63].
Hi n nay, M.tuberculosis ki u gen Beijing là m i quan tâm l n các n c có b nh lao phát tri n m nh, b i vì đây là ch ng chi m u th trong các
Lu n v n th c s sinh h c Khi u Th Thúy Ng c ---
27
ch ng M.tuberculosis phân l p đ c t các n c này. Nhi u nghiên c u v d ch t h c phân t và di truy n ti n hóa c a M.tuberculosis nh Dou H.Y. và c ng s (2008), Hue G.(2009)... đã cho th y r ng ch ng M.tuberculosis ki u gen Beijing có kh n ng phát tri n nhanh h n cùng v i b ch c u ng i so v i các ch ng khác. Chúng có th xâm nhi m và bi u hi n thành b nh cao, đ c bi t đ i v i c nh ng ng i đã đ c tiêm phòng vaccine lao (BCG) [25, 39].
Hình 15. T l phân b M.tuberculosis ki u gen Beijing trên th gi i [35].
Judith R.Glynn và c ng s (2002) đã ti n hành xem xét có h th ng các báo cáo đã đ c công b v t l M.tuberculosis ki u gen Beijing trên th gi i nh m xác đinh s phân b , lây lan và m i liên quan c a ch ng vi khu n này v i tính kháng thu c lao. K t qu cho th y có m i liên quan ch t ch gi a các
M.tuberculosis ki u gen Beijing và tính kháng thu c lao, đ c bi t x y ra New York, Cuba, Estonia và Vi t Nam [35].
Trong m t s nghiên c u c a ng c Anh và c ng s n m 2000 [13], Nguy n Th Ng c Lan n m 2003 [48], Tr n Ng c B u n m 2009 [20] cho th y kho ng 50% b nh nhân lao Vi t Nam do M.tuberculosis ki u gen
Lu n v n th c s sinh h c Khi u Th Thúy Ng c ---
28
Beijing gây ra. Ch ng này có liên quan đ n b nh nhân tr tu i và tính kháng thu c lao.
Nghiên c u s l u hành và phân b M.tuberculosis ki u gen Beijing, s gia t ng các vi khu n lao kháng thu c là nh ng v n đ r t c n thi t, góp ph n tích c c cho công tác ki m soát b nh lao t i Vi t Nam.
Lu n v n th c s sinh h c Khi u Th Thúy Ng c --- 29
CH NG II: V T LI U VÀ PH NG PHÁP NGHIÊN C U
2.1. V T LI U 2.1.1. i t ng, th i gian và đa đi m nghiên c u i t ngChúng tôi ti n hành nghiên c u 1575 ch ng VK lao thu th p đ c t b nh nhân lao ph i AFB (+) thu c đ tài “ i u tra tình hình kháng thu c c a vi khu n lao n m 2005 “. Các khu n l c c a VK lao đ c b o qu n l nh -720 C t i “ngân hàng” ch ng thu c khoa Vi sinh – B nh vi n Ph i Trung
ng.
M u nghiên c u đ c chia làm hai nhóm:
- Nhóm 1 g m 1390 ch ng Vk lao phân l p t b nh nhân ph i AFB (+) m i (b nh nhân lao m i ch a dùng ho c đã dùng thu c lao d i 30 ngày). - Nhóm 2 g m 185 ch ng VK lao phân l p t b nh nhân lao ph i AFB (+) đã đi u tr (b nh nhân lao đã đi u tr thu c lao ít nh t 30 ngày).
Các ch ng VK lao đ c phân l p t b nh nhân t i 80 đi m nghiên c u trên toàn qu c và đ c phân chia theo 3 mi n (chi ti t xem t i ph l c 1).
- Mi n B c g m 27 đi m nghiên c u (s th t 1 đ n 27). - Mi n Trung g m 11 đi m nghiên c u (s th t 28 đ n 38). - Mi n Nam g m 42 đi m nghiên c u (s th t 39 đ n 80).
T t c các ch ng VK lao đã có k t qu kháng sinh đ theo ph ng pháp t l gián ti p c a Canetti – Groseet v i 4 thu c lao hàng m t là isoniazid (INH) 0.2 µg/ml, rifampicin (RIF) 40µg/ml, streptomycin (SM) 4µg/ml, ethambutol (EMB) 2 µg/ml [33].
Lu n v n th c s sinh h c Khi u Th Thúy Ng c ---
30
Th i gian và đ a đi m nghiên c u
Nghiên c u đ c ti n hành t i phòng xét nghi m chu n Qu c gia v lao – khoa Vi sinh, B nh vi n Ph i Trung ng t tháng 3/2008 đ n tháng 9/2010.
2.1.2. Hóa ch t và trang thi t b
Hóa ch t
Các hoá ch t tinh khi t chính đ c s d ng trong nghiên c u g m:
PCR Beads GE Healthcare
Màng lai g n oligonucleotides GE Healthcare
M i cho ph n ng PCR Invitrogen
Streptavidin - POD- Conjugate Boehringer
ECL Detection Reagents GE Healthcare
Miniblotter MN45 Immunetics ,USA
SDS BDH Laboratory
EDTA SIGMA
Na2HPO4 * 2H2O SIGMA
Thu c tráng phim FUJI
Công th c pha hóa ch t đ c trình bày chi ti t ph l c 2.
Trang thi t b
Phim X-ray GE Healthcare
Mi ng đ m lai Immunetics ,USA T ATSH c p II Máy l c ngang
T l nh 4o /- 20o/-80o Pipette t đ ng các lo i
Lu n v n th c s sinh h c Khi u Th Thúy Ng c ---
31
N i h p kh trùng Lò lai DNA
Máy ly tâm H p phim X-ray
Máy vortex H th ng bu ng t i tráng phim
Máy PCR H th ng máy tính
2.2. PH NG PHÁP NGHIÊN C U 2.2.1. N i dung nghiên c u 2.2.1. N i dung nghiên c u
Các b c ti n hành nghiên c u g m:
B c 1. L p danh sách ch ng VK lao c n nghiên c u. C p nh p các thông tin ti n s đi u tr b nh c a b nh nhân và k t qu kháng sinh đ c a ch ng VK gây b nh. Chia m u nghiên c u thành hai nhóm.
Nhóm 1(N1) g m 1390 ch ng VK lao phân l p t b nh nhân lao ph i AFB (+) m i.
Nhóm 2(N2) g m 185 ch ng VK lao phân l p t b nh nhân lao ph i AFB (+) đã đi u tr .
B c 2. Chu n b ch ng VK lao. L y ch ng vi khu n t t b o qu n -720C và s p x p theo danh sách đã trích l c.
B c 3. Tách tri t DNA c a ch ng VK lao theo quy trình chu n c a Vi n nghiên c u S c kh e và Môi tr ng Hà Lan – RIVM.
B c 4. Th c hi n ph n ng PCR nhân gen vùng DR c a VK lao
B c 5. Lai s n phâm PCR v i màng lai Biodyne C đã có g n các trình t oligonucleotide (xem ph l c 3).
B c 6. Phát hi n tín hi u lai b ng ph n ng quang hóa s d ng ECL. Tín hi u lai đ c bi u hi n trên phim X-ray (xem ph l c 4).
B c 7. Nh n di n tín hi u lai, s hóa và c p nh p vào máy tính. So sánh v i c s d li u SpolBD4 đ có k t qu ki u gen M.tuberculosis t ng ng.
Lu n v n th c s sinh h c Khi u Th Thúy Ng c ---
32
B c 8. X lý và phân tích s li u: Xác đ nh t l phân b và phân tích m i liên quan đ n tính kháng thu c lao c a M.tuberculosis ki u gen Beijing.
Hình 16. S đ nghiên c u
Thu th p ch ng M.tuberculosis
Nhóm 1:1390 ch ng M.tuberculosis
t BN lao ph i AFB (+) m i Nhóm 1:185 ch ng t BN lao ph i AFB (+) M.tuberculosisđã đi u tr
Tách DNA M.tuberculosis Nhân vùng gen DR b ng c p m i Dra và Drb Lai s n ph m PCR v i màng Biodyne C Phát hi n tín hi u lai b ng ECL trên phim X-ray
Nh n di n tín hi u lai, so sánh và
phân lo i ki u gen M.tuberculosis
Xác đnh phân b
Lu n v n th c s sinh h c Khi u Th Thúy Ng c ---
33
2.2.2. Ph ng pháp Spoligotyping - spacer oligonucleotide typing
Ph ng pháp spoligotyping d a trên c s c a k thu t lai phân t , b ng cách cho lai các s n ph m PCR c a vùng l p l i tr c ti p (DR) c a vi khu n lao v i các trình t oligonucleotid đ c tr ng cho vùng này đ c c đ nh trên màng lai. Tín hi u lai khác nhau cho phép phân chia các ch ng
M.tuberculosis thành các nhóm khác nhau [47].
Các b c ti n hành k thu t:
Chu n b v t li u
L y hai ng khu n l c VK lao cho vào tuýp eppendorf ch a 250 µl 1×TE. Gi t vi khu n 80 º C/60 phút. Ly tâm 13000 rpm/2 phút. Ch t b n c n i. R a hai l n v i 500µl dung d ch 150 mM NaCl. Ch t b n c n i r i cho thêm 400 µl 1×TE.
Các dung dich hóa ch t đ c pha theo công th c trình bày ph l c. Màng lai Biodyne C đã đ c g n các oligonucleotide.
M u ch ng d ng là hai ch ng M. tuberculosis H37Rv và M.bovis P3. M u ch ng âm là n c c t tinh khi t.
Tách tri t DNA
tách chi t DNA VK lao cho nghiên c u này chúng tôi đã áp d ng ph ng pháp tách chi t DNA theo quy trình chu n c a Vi n nghiên c u S c kh e và Môi tr ng Hà Lan – RIVM theo các b c sau [60]:
- Tuýp Eppendorf ch a VK lao trong 400 µl 1×TE trên đ c b sung 50l 10 mg/ml lysozyme, l c k và ít nh t 1 gi 37°C.
Lu n v n th c s sinh h c Khi u Th Thúy Ng c ---
34 - Thêm 100 l 5 M NaCl.
- Thêm 100 l CTAB/NaCl . Dung d ch này c n gi 65°C tr c khi dùng . L c k r i 65°C/10 phút
- Thêm 750 l Chloroform/isoamyl alcohol (24:1), L c 10 giây và ly tâm 12000 v/ 5 phút nhi t đ phòng (RT) - Hút h t d ch n i sang tuýp s ch khác. - Thêm 450 l isopropanol. - t vào đá l nh kho ng 10 phút . - Ly tâm 15 phút nhi t đ phòng. - Hút b n c n i , r a c n b ng 1 ml 70% ethanol , ly tâm 12000 v/ 5 phút Hút b n c n i , làm khô c n.
- Thêm 20 l of 1xTE . B o qu n DNA 4°C đ n khi s d ng
Th c hi n ph n ng PCR nhân gen vùng DR c a VK lao
B ng 2. Thành ph n ph n ng PCR nhân gen vùng DR c a VK lao
Thành ph n N ng đ cho ph n ng Th tích cho 1 ph n ng (µl) Dra (g n biotin ) 0,40 M 4,00 Drb 0,40 M 4,00 dNTPs 0,20 mM 4,00 MgCl2 1,50 mM 1,50 Tag 0,75 U/ l 0,15 Buffer 10X 1,00 X 5,00 N c c t tinh khi t 29,35
Lu n v n th c s sinh h c Khi u Th Thúy Ng c --- 35 DNA m u 30,00 ng/ l 2,00 T ng th tích 50,00 Ch ng trình ch y PCR: B c 1 960C 3 phút B c 2 960C 1 phút 25 chu k 550C 1 phút 720C 30 giây B c 3 720C 5 phút Gi 40C
Sau khi nhân gen, s n ph m PCR s đ c đi n di trên gel agarose 1%
trong th i gian 30 phút đ ki m tra k t qu c a ph n ng PCR c ng nh ki m
tra n ng đ s n ph m có đ đ th c hi n ph n ng lai hay không.
Lai s n ph m PCR v i màng lai
Chu n b hóa ch t cho vào b n nhi t nh sau:
- 250 ml 2xSSPE/0,1% SDS đ t 600C - 500 ml 2xSSPE/0,5% SDS đ t 600C - 500 ml 2xSSPE/0,5% SDS đ t 420C
Lu n v n th c s sinh h c Khi u Th Thúy Ng c ---
