- Kỹ thuật ELISA Sandwich
ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Khuếch đại gen mã hố protein p24 của HIV bằng phương pháp Nested-
PCR (PCR lồng)
Gen p24 được khuếch đại bằng phương pháp Nested – PCR (PCR lồng) với hai cặp mồi:
Bảng 2.1: Trình tự 2 cặp mồi khuếch đại gen mã hĩa protein p24
Cặp mồi vịng 1 Trình tự mồi Tm P24EPN 5’- AAACATTTAGTATGGGCAAGCAG - 3’ 53,80C P24EMN 5’ – TGGCTAGGTCCTCCCACTCC - 3’ 60,70C Cặp mồi vịng 2 Trình tự mồi Tm P24PT 5’ – CACAAGGGCAAATGGTACATCC - 3’ 54,20C P24MT 5’- AAATGGACTTACAGTCTGGATTCG - 3’ 54,80C
Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Thành phần của phản ứng PCR vịng 1:
Bảng 2.2: Thành phần phản ứng PCR vịng 1
Thành phần Nồng độ Thểtích (l)
Nước khử ion vơ trùng 16,3
Dung dịch đệm cho Taq 10X 2,5
dNTP 2,5 mM 2,0
P24EPN 10 pmol/l 1,0
P24EMN 10 pmol/l 1,0
Taq DNA polymerase 5U/l 0,2
DNA template 50~100 ng 2,0
Tổng thể tích 25,0
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR vịng 1 bao gồm các bước sau: 940 C – 3 phút, 940C – 1 phút, 530C – 1 phút, 720C – 1 phút 20 giây, 30 chu kỳ (từ bước 2 đến bước 4), 720
C – 8 phút, kết thúc ở 40C.
Thành phần của phản ứng vịng 2:
Bảng 2.3: Thành phần phản ứng PCR vịng 2
Thành phần Nồng độ Thể tích(l)
Nước khử ion vơ trùng 16,1
Dung dịch đệm cho Taq 10X 2,5
dNTP 2,5 mM 2
P24PT 10 pmol/l 1
P24MT 10 pmol/l 1
Taq DNA polymerase 5U/l 0,2
Sản phẩm PCR vịng 1 2
Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR vịng 2 như sau: 940
C – 3 phút, 940C – 1 phút, 530C – 1 phút, 720C – 1 phút 30 giây, 30 chu kỳ (từ bước 2 đến bước 4), 720C – 8 phút, kết thúc ở 40
C.
Sản phẩm PCR vịng 2 theo lý thuyết là 588 bp, được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% và bảo quản ở -200
C.
2.2.2. Khuếch đại gen mã hố protein P24 của HIV bằng cặp mồi biểu hiện
Gen p24 được khuếch đại bằng cặp mồi biểu hiện cĩ gắn trình tự nhận biết
của hai enzyme giới hạn BamH I và Xho I bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi
P24BAM và P24XHO cĩ trình tự:
P24Bam: 5’- TGGATCCCAAGGGCAAATGGTACATCAGC -3’ P24Xho: 5’- TCTCGAGTGGATTCGCATTTTGGACTAGC -3’
Ghi chú: GGATCC: vị trí nhận biết của enzym giới hạn BamH I, CTCGAG:
vị trí nhận biết của enzym giới hạn Xho I.
2.2.3. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose
Các đoạn DNA cĩ khối lượng và diện tích khác nhau được tách ra khi di chuyển từ cực âm sang cực dương của máy đ iện di trong mợt điện trường có điện thế và cường đợ thích hợp. Hĩa chất điện di: Agarose 1% (1g agarose pha trong 100 ml dung dịch đệm TAE 1X); dung dịch đệm TAE 50X (60,5 g Tris base; 14,3ml axit axetic; 25ml EDTA 0,5M, pH 8.0), 10mg/ml EtBr (ethidium bromide), đệm tra mẫu 10X (loading buffer: 0,1 ml bromophenol blue 10%; 0,3% glyxerol 100% và định mức bằng H2O đến 1ml) [60,63].
2.2.4. Phương pháp gắn gen vào vector
- Tách dịng đoạn gen mã hố cho protein p24 của virus HIV được tiến hành bằng cách gắn trực tiếp sản phẩm PCR vào vector tách dịng PCR 2.1 bằng việc sử dụng bộ sinh phẩm tách dịng của hãng Invitrogen.
Thành phần phản ứng:
Nước khử ion vơ trùng : 3 µl
Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Vector PCR 2.1 : 2 µl
T4 DNA ligase : 1 µl
DNA template : 3 µl
Tổng thể tích : 10 µl
Hỗn hợp phản ứng được tiến hành (ủ) ở nhiệt độ 14oC qua đêm
- Thiết kế vector biểu hiện gen p24: được tiến hành bằng cách gắn đoạn gen mã hĩa cho protein p24 (đã được gắn thêm trình tự nhận biết của hai enzyme giới hạn BamH I và Xho I) vào vector biểu hiện pET 32a(+) đã được xử lý bằng enzyme giới hạn trên.
Thành phần phản ứng:
Nước khử ion vơ trùng : 2,5 µl
Dung dịch đệm của T4 ligase : 1,5 µl
Vector pET32a(+) : 6 µl
Enzyme T4 ligase : 1 µl
DNA template : 4 µl
Tổng thể tích : 15 µl Phản ứng được ủ ở 140C qua đêm.
2.2.5. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến E.coli
+ Tạo tế bào khả biến:
(1) Tế bào E. coli được nuơi qua đêm trong 5ml mơi trường LB lỏng; (2) Pha lỗng huyền dịch tế bào đã nuơi cấy theo tỉ lệ 1:100 trong 5ml mơi trường LB ; (3) Nuơi lắc ở 370
C, 200 vịng/phút (v/p), sau 2h kiểm tra mật đợ tế bào , giá trị OD 600nm đạt 0,6-1 là đạt yêu cầu ; (4) Chuyển 1ml dịch tế bào sang ớng Ep (eppendorf) vơ trùng, để trên đá trong 10 phút; (5) Ly tâm thu sinh khới ở 40C, tớc đợ 5000v/p trong 5 phút; (6) Rửa cặn tế bào lần 1 bằng 1ml CaCl2 100mM (Vdich : VCaCl2; 1:1) ở 40C; (7) Ly tâm loại bỏ dịch nổi; (8) Rửa lại cặn tế bào lần 2 bằng 100μl Cacl2 100mM (Vdich:Vcacl2, 10:1). (9) Ly tâm tốc độ 5000v/p trong 5 phút, thu cặn; (10) Hịa cặn tế bào thành huyền dịch trong 50l CaCl2 100mM, giữ trong đá ít nhất 1 giờ trước khi biến nạp.
Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
+ Biến nạp:
(1) Bở sung tồn bộ sản phẩm của phản ứng ligation vào ống tế bào khả biến; (2) Để trên đá trong 30 phút; (3) Sớc nhiệt ở 420C trong 1 phút 30 giây; (4) Bở sung 250l mơi trường LB lỏng , nuơi lắc với tớc đợ 200v/p, ở 370
C trong 1 giờ; (5) Cấy trải trên mơi trường thạch LBA , X-gal, IPTG); (6) Ủ đĩa đã cấy trong tủ ấm 370
C qua đêm [60].
2.2.6. Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn
- Thu 1,5ml dịch tế bào nuơi qua đêm ở 370
C trên mơi trường LB lỏng từ. - Ly tâm huyền dịch thu tế bào với tốc độ 12.000 vịng/phút trong thời gian
1 phút, thu cặn tế bào.
- Bổ sung 150µl Sol I (Tris-HCl 50mM, pH 8.0; EDTA 10mM, pH 8.0), vortex.
- Bổ sung tiếp 150µl Sol II (200mM NaOH; SDS 1%), đảo nhẹ.
- Bổ sung tiếp 150µl Sol III (Kac-Potasium Acetat 3M, pH 5.5), đảo nhẹ. - Thêm 450µl chloroform:isoamylalcohol (24:1), đảo nhẹ.
- Ly tâm với tốc độ 12.000 vịng/phút trong thời gian 15 phút.
- Hút 400μl dịch nổi ở pha trên cùng sang ống Eppendort loại 1,5ml mới - Bổ sung 40μl NaOAC 3M, pH 5,2 và 1ml Ethanol 100%.
- Tủa DNA ở - 200C trong thời gian 2 giờ.
- Ly tâm 12.000 vịng/phút trong thời gian 30 phút, thu cặn. - Rửa cặn bằng 500µl Ethanol 70%.
- Ly tâm với tốc độ 12.000 vịng/phút trong thời gian 15 phút, thu cặn. - Làm khơ cặn bằng máy speed vac.
- Hồ lại cặn trong 40µl đệm TE cĩ bổ sung Rnase. - Ủ ở 370C trong thời gian 1 giờ để loại RNA. - Điện di kiểm tra trên gel agarose 1%
2.2.7. Phương pháp cắt DNA bằng enzym giới hạn
Thành phần phản ứng cắt DNA bằng enzym giới hạn: Dung dịch đệm cho enzyme : 1,0 µl
Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
DNA template : 2,0 µl Enzyme giới hạn : 0,4 µl Nước khử ion vơ trùng : 6,6 µl Tổng thể tích : 10 µl
Hỗn hợp phản ứng được trộn đều, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp tuỳ vào loại enzyme (thường là tại nhiệt độ 370C trong thời gian 2 giờ hoặc qua đêm).
2.2.8. Phương pháp tinh sạch DNA plasmid
Để tinh sạch vectơ tái tổ hợp phục vụ cho mục đích đọc trình tự, chúng tơi sử dụng bộ sinh phẩm S.N.A.P Miniprep Kid của hãng Invitrogen. Quá trình này gồm 2 bước cơ bản:
- Gắn plasmid lên cột.
- Đẩy DNA plasmid ra khỏi cợt.
2.2.9. Phương pháp xác định trình tự DNA
Trình tự DNA được xác định theo phương pháp của Sanger tr ên máy xác định trình tự DNA tự đợng ABI prism 3100 Sequencer (Applied Biosystems) với bợ Kit xác định trình tự BigDye ® Terminater v3.1 Cycle Sequencing Kit của hãng Applied Biosystems. Quy trình xác định trình tự được tiến hành theo 3 bước:
- Bƣớc 1: Thực hiện phản ứng tởng hợp với các thành phần như bảng 2.4 Bảng 2.4: Thành phần phản ứng để xác định trình tự
Thành phần Thể tích(l)
Nước khử ion vơ trùng 5,725
Bigdye 3
DNA (200 ng) 2
Mời (3,2 pmol) 1,275
Đệm 2.5X 3
Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chu trình nhiệt được thực hiện như sau : 960
C 1 phút, 960C 10 giây, 500C 5 giây, 600C 4 phút, 25 chu kỳ (từ bước 2 đến bước 4bước 4), 600C 4 phút, kết thúc ở 40C.
- Bƣớc 2: Tinh sạch sản phẩm sau khi tởng hợp
+ Bở sung 5l EDTA 125mM, pH=8.
+ Bở sung 60l Ethanol 100%. Ủ ở nhiệt độ phịng trong 15 phút + Ly tâm 12000 v/p trong 20 phút, thu cặn
+ Rửa cặn bằng 60l Ethanol 70%. Ly tâm 12.000 v/p trong 10 phút, thu cặn + Làm khơ cặn trong 10 phút bằng máy Speed vac
+ Hịa cặn trong 10 l Hidiformamide + Biến tính ở 950C trong 3 phút
- Bƣớc 3: Xác định trình tự trên máy tự động ABI 3100 Avant.
2.2.10. Thu đoạn DNA từ gel agarose
Để thu đoạn DNA từ gel agarose, chúng tơi sử dụng bộ sinh phẩm S.N.A.P free UV của hãng Invitrogen. Quá trình này gồm 4 bước cơ bản:
- Thu băng DNA cần quan tâm. - Gắn DNA lên cột.
- Rửa cột các tạp chất - Đẩy DNA ra khỏi cợt
Sau đĩ tiến hành điện di kiểm tra DNA trên gel agarose
2.2.11. Phương pháp biểu hiện protein tái tổ hợp trong E. coli
- Nuơi hoạt hố tế bào vi khuẩn E. coli BL21 Star™ (DE3) mang plasmid tái tổ hợp trong mơi trường LB lỏng cĩ bổ sung Amp ở 370
C, lắc qua đêm.
- Cấy chuyển 2% dịch hoạt hố sang mơi trường LB lỏng mới cĩ bổ sung kháng sinh, tiếp tục nuơi lắc ở 37oC đến khi OD đạt 0,6-1 (sau khoảng 2 – 3 giờ).
- Cảm ứng bằng IPTG với nồng độ thích hợp. - Tiếp tục nuơi lắc ở 370
C. Sau 3 giờ, ly tâm, thu cặn tế bào.
- Hồ tan cặn tế bào trong 40l H20 khử ion vơ trùng, bổ sung thêm 10l đệm SDS 5X. Ủ mẫu ở 95oC trong 10 phút để phá vỡ tế bào và biến tính protein.
Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Ly tâm 6000 v/p trong thời gian 5 phút để loại xác tế bào. - Hút dịch pha trên chạy điện di trên gel polyacrylamide 12,5%.
2.2.12. Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide
Điện di gel polyacrlamide được tiến hành theo phương pháp của Laemmli, sử dụng bộ điện di của hãng BioRad (Mỹ). Kỹ thuật này thường được sử dụng để phân tách các băng protein cĩ trọng lượng phân tử khác nhau. Chúng tơi sử dụng kỹ thuật này để kiểm tra các protein tái tổ hợp sau khi biểu hiện. Quá trình điện di được tiến hành như sau:
Đổ gel theo cơng thức
Mẫu sau khi xử lý và biến tính được tra vào các giếng nhỏ trong gel.
Tiến hành chạy điện di với cường độ dịng điện thích hợp
Sau khi chạy xong, bản gel được gỡ ra và nhuộm trong dung dịch Comasie Brilliant blue, lắc khoảng 30 phút đến 2 giờ, sau đĩ thay bằng dịch tẩy, lắc trong 30 phút, cho nước vào và cĩ thể quan sát trực tiếp.
2.2.13. Tinh chế protein tái tổ hợp bằng cột Probond Nickel- Chelating Resin
Theo thiết kế protein tái tổ hợp cĩ gắn thêm 6 histidine (6-His) nên dễ dàng được tinh sạch bằng cột sắc ký ái lực ProBond Nickel-Chelating Resin (Invitrogen). Phương pháp tinh sạch này dựa vào liên kết giữa ion Ni2+
với vịng imidazole của histidine. Cơt này cĩ khả năng gắn các protein mang amino acid histidine do vịng imidazole của histidine sẽ liên kết với ion kim loại trên cột và giữ protein lại trên cột. Các protein khơng cĩ ái lực hoặc cĩ ái lực yếu với ion kim loại trên cột sẽ bị rửa trơi trong quá trình tinh sạch.
Quá trình tinh sạch được tiến hành theo hướng dẫn của hãng Invitrogene, các bước cĩ thể được tĩm tắt như sau:
- Siêu âm phá vỡ tế bào trong đệm DBB (Denature Binding Buffer) - Ly tâm loại xác tế bào, thu dịch nổi
- Đưa dịch nổi lên cột
- Rửa cột, loại những protein tạp bám khơng đặc hiệu
Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Kiểm tra độ tinh sạch bằng điện di trên gel polyacrylamide
2.2.14. Phương pháp Western blot
Phương pháp Western blot để kiểm tra khả năng phản ứng của kháng thể trong huyết thanh bệnh nhân với protein p24 tái tổ hợp. Protein p24 tái tổ hợp được điện di trên gel polyacrylamide 12,5% sau đĩ được chuyển sang màng polyvinyl- idene-difluoride (PVDF), nhuộm màng tạm thời bằng dung dịch 0,1% Ponceau để đánh dấu vị trí của băng protein tái tổ hợp. Phủ màng bằng 5% Skin milk trong dung dịch đệm Tween20-Tris-HCl Buffed Solution (TTBS: 25 ml Tris-HCl 1M, pH 7,5; 10 ml NaCl 5M; 500 μl Tween 20; H2O khử ion vừa đủ 1000 ml). Dùng màng này để phát hiện kháng thể kháng virus HIV trong huyết thanh bệnh nhân. Huyết thanh bệnh nhân được pha lỗng 10.000 lần trong dung dịch đệm TTBS chứa 1% skin milk rồi cho phản ứng với protein tái tổ hợp trên màng. Kháng thể kháng virus HIV được phản ứng với cộng hợp kháng IgG người gắn enzyme Horseradish peroxidase (HRP). Phản ứng hiện màu được thực hiện với cơ chất 4-chloro-1- naphtol [60,61].
2.3.15 Định lượng protein bằng phương pháp Bradford
Hàm lượng protein trong các mẫu thí nghiệm được xác định theo phương pháp Bradford. Đồ thị chuẩn được dựng với albumin huyết thanh bị (BSA) với thang chuẩn từ 0 – 1 mg/ml.
Bổ sung 5 µl các nồng độ BSA từ 0-1mg/ml và 5 µl mẫu protein cần xác định nồng độ vào mỗi giếng trên phiến 96 giếng. Bổ sung 250 µl dung dịch Bardford Reagent 5X (0,5 mg/ml Comassie Blue G; 25% Methanol; 42,5% H3PO4), lắc 1 phút. Ủ mẫu ở nhiệt độ phịng trong 30 phút sau đĩ đo OD ở bước sĩng 595 nm.
Dựng đồ thị chuẩn (trục tung là giá trị OD595, trục hồnh biểu thị nồng độ protein), từ đường chuẩn, xác định nồng độ của protein cần thiết [60]
Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
CHƢƠNG 3