- Kỹ thuật ELISA Sandwich
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tách dịng gen p24 của H
3.2 Thiết kế vector biểu hiện mang gen p
3.2.1 Khuếch đại gen p24 của HIV bằng mồi biểu hiện
Do gen p24 được tách dịng trong vector pCR2.1 khơng mang các vị trí nhận biết của các enzyme giới hạn mong muốn để gắn vào vector biểu hiện, vì vậy để cĩ thể thiết kế vector biểu hiện gen p24, chúng tơi tiến hành khuếch đại lại gen p24 từ vector tách dịng bằng phương pháp PCR sử dụng cặp mồi P24PT và P24MT cĩ
Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
treo trình tự nhận biết của hai enzyme giới hạn ở đầu 5’ tương ứng là BamHI và XhoI.
Hình 3.7: Kết quả nhân bản gen p24 từ vector tái tổ hợp
Kết quả điện di kiểm tra trên gel agarose 1% sản phẩm PCR cho thấy đoạn gen p24 được khuếch đại đặc hiệu với kích thước đúng với dự đốn là khoảng 584 bp (hình 3.7). Sản phẩm PCR này sau đĩ được xử lý bằng 2 enzyme BamHI và XhoI và gắn trực tiếp vào vector biểu hiện pET32a(+) tại 2 vị trí của enzyme tương
ứng.
Chọn lọc các dịng plasmid pET32a+ tái tổ hợp mang gen p24
Chúng tơi tiến hành các bước thí nghiệm như đã trình bày ở trên với vector tách dịng để chọn lọc dịng plasmid pET32a(+) tái tổ hợp mang gen p24. Qua phân tích bằng cắt với enzyme giới hạn, chúng tơi đã thu được 5 dịng plasmid tái tổ hợp mang gen p24 (kết quả khơng nêu ở đây)
3.2.2 Kiểm tra khung đọc của gen p24 trong vector pET32a(+)
Gen p24 trong vector pET32a(+) chỉ cĩ thể biểu hiện khi chúng được gắn
đúng chiều, đúng khung đọc mở và được dịch mã thơng suốt, khơng cĩ mã kết thúc trong gen. Do đĩ, chúng tơi lựa chọn 2 dịng plasmid pET32a(+) tái tổ hợp mang đoạn gen mã hĩa protein p24 trong tổng số 5 dịng plasmid đã phân tích bằng cắt với enzyme giới hạn ở trên để tiến hành giải trình tự gen.
Kết quả giải trình tự và dịch mã ra trình tự các amino acid suy diễn cho thấy đoạn gen p24 thu được trong vector pET32a(+) cĩ khung đọc đúng, cĩ mã khởi đầu
Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
và kết thúc, khơng cĩ mã kết thúc trong gen, đảm bảo cho quá trình biểu hiện thành cơng trong vi khuẩn (các kết quả khơng trình bày ở đây).
3.2.3 Biểu hiện gen p24 trong vi khuẩn E. coli
Để biểu hiện gen mã hĩa protein p24, chúng tơi sử dụng chủng biểu hiện E.
coli BL21 (DE3) Star™. Chủng này cĩ ưu điểm là hạn chế được sự phân cắt của
protease đối với protein ngoại lai, giúp cho protein ngoại lai ổn định hơn trong tế bào sau khi được tổng hợp. Ngồi ra DNA hệ gen của E. coli BL21 (DE3) Star™ cĩ chứa gen mã hĩa cho T7 RNA polymerase, cĩ nguồn gốc từ bacteriophage λ DE3. Gen này được đưa vào hệ gen E. coli BL21 (DE3) Star™ và đặt dưới sự điều khiển của promoter lacUV5 nên cần IPTG để cảm ứng sự biểu hiện T7 RNA polymerase [65].
Vector biểu hiện tái tổ hợp mang gen p24 với khung đọc chuẩn được biến
nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli BL21 (DE3) Star™ bằng phương pháp sốc nhiệt.
Dịch tế bào sau khi biến nạp được cấy trải trên mơi trường LB đặc cĩ bổ sung Amp và nuơi ở 370C qua đêm. Kết quả biến nạp thu được các khuẩn lạc trịn riêng rẽ. Chọn 2 khuẩn lạc riêng rẽ bất kỳ, nuơi qua đêm trong mơi trường LB lỏng cĩ bổ sung Amp và lắc với tốc độ 200 v/p ở 37oC. Sau đĩ dịch nuơi cấy qua đêm được cấy chuyển sang mơi trường LB lỏng (tỷ lệ 1:100) cĩ bổ sung Amp và nuơi lắc tiếp cho đến khi OD600 đạt 0,6-0,8 (khoảng 2-3 giờ) thì bổ sung chất cảm ứng IPTG đến nồng độ cuối cùng là 1mM và nuơi tiếp ở 370C trong 3 giờ. Protein tổng số của dịch chiết tế bào đã được phân tích trên gel polyacrylamide 12,5% (hình 3.8).
Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.8: Kết quả biểu hiện protein tái tổ hợp p24 kiểm tra trên gel polyacrylamide 12,5%.
Giếng 1: Marker protein
Giếng 2, 4: Mẫu khơng cảm ứng với IPTG Giếng 3,5: Mẫu cảm ứng với IPTG
Protein tái tổ hợp p24 được tổng hợp bao gồm 109 amino acid của Thioredoxin, 6 histidine dung hợp với 195 amino acid của p24. Tổng cộng là 310 amino acid, như vậy tính theo lý thuyết thì trọng lượng phân tử của protein tái tổ hợp khoảng 36kda. Kết quả điện di cho thấy xuất hiện một băng protein đậm ở mẫu cảm ứng cĩ kích thước khoảng 36kda, kích thước này phù hợp với các tính tốn lý thuyết của chúng tơi (hình 3.8).