- Kỹ thuật ELISA Sandwich
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tách dịng gen p24 của H
3.3 Tối ƣu hĩa điều kiện biểu hiện
Trước khi biểu hiện lượng lớn để thu nhận lượng protein tái tổ hợp phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo, chúng tơi tiến hành khảo sát các điều kiện nuơi cấy nhằm tìm ra điều kiện biểu hiện tối ưu nhất.
3.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuơi cấy
Nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng phát triển của tế bào vật chủ chứa plasmid tái tổ hợp, qua đĩ ảnh hưởng đến hiệu suất và chất lượng protein tái tổ hợp. Một số protein ngoại lai được tổng hợp tốt ở 370C khi tốc độ sinh trưởng của chủng đạt tối đa. Tuy nhiên, khi tế bào phát triển mạnh protein tái tổ hợp
1 2 3 4 5 6 6
Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
được tổng hợp ra liên tục thì một phần protein này tồn tại ở dạng khơng hịa tan. Các protein ở trạng thái khơng tan thường khơng đảm bảo được hoạt tính sinh học. Vì vậy cần phải khảo sát các nhiệt độ nuơi cấy để tìm ra nhiệt độ nuơi cấy thích hợp, mà ở đĩ protein ngoại lai được tổng hợp nhiều và cĩ chất lượng tốt.
Để tiến hành khảo sát, chúng tơi nuơi cấy chủng E. coli BL21 (DE3) Star™ mang vector pET32a+ tái tổ hợp ở 370C đến khi OD600 đạt 0,6-0,8. Sau đĩ, tế bào được cảm ứng bởi 1mM IPTG và tiếp tục được nuơi lắc ở 28, 30 và 370
C trong 3 giờ. Sau đĩ các mẫu được xử lý với điều kiện như nhau và tiến hành kiểm tra bằng điện di trên gel polyacrylamide 12,5%.
Hình 3.9: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đối với khả năng sinh tổng hợp protein p24 tái tổ hợp
Giếng 1: Marker protein
Giếng 2, 4, 6: Mẫu khơng cảm ứng được nuơi cấy ở 28, 30, 370
C Giếng 3, 5, 7: Mẫu cảm ứng bằng 1mM IPTG được nuơi cấy ở 28, 30, 370C.
Kết quả phân tích bằng điện di trên gel polyacrylamide (hình 3.9) cho thấy nhiệt độ ảnh hưởng khác nhau tới quá trình sinh tổng hợp protein tái tổ hợp. Tại 370C, kết quả tổng hợp protein tái tổ hợp là tốt nhất. Tuy nhiên khi kiểm tra trạng thái biểu hiện của protein p24 tái tổ hợp thì ở cả 3 nhiệt độ khảo sát trên, p24 đều biểu hiện ở dạng hịa tan. Vì vậy chúng tơi chọn 370
C là nhiệt độ nuơi cấy cho các nghiên cứu tiếp theo (kết quả khơng trình bày ở đây).
kDa 36kDa 14,4 18 35 25 45 62,5 116
Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ IPTG
Để kiểm tra ảnh hưởng của nồng độ IPTG lên quá trình tổng hợp protein ngoại lai, chúng tơi đã nuơi cấy chủng E. coli BL21 Star™ (DE3) mang vector
pQH09-p24 ở 370C đến khi OD600 đạt 0,6-0,8. Sau đĩ, bổ sung với các nồng độ IPTG khác nhau: 0; 0,25; 0,5; 0,75; 1mM và tiếp tục được nuơi lắc ở 370C trong 3 giờ. Kết quả phân tích bằng điện di trên gel polyacrylamide cho thấy nồng độ IPTG khác nhau cĩ ảnh hưởng khác nhau tới quá trình sinh tổng hợp protein tái tổ hợp (hình 3.10).
Hình 3.11: Ảnh hƣởng của nồng độ IPTG (mM) lên khả năng sinh tổng hợp protein p24 tái tổ hợp
Giếng 1: Marker protein
Giếng 2: Mẫu đối chứng, khơng cảm ứng bằng IPTG
Giếng 3, 4, 5, 6: Mẫu cảm ứng bằng các nồng độ IPTG tương ứng là 0,2; 0,5; 0,75;1mM.
Từ kết quả điện di cho thấy lượng protein tái tổ hợp thu được tại các nồng độ: 0,5mM; 0,75mM ; 1mM gần như là tương đương (hình 3.11). Vì thế chúng tơi đã chọn nồng độ tối ưu cho chất cảm ứng (IPTG) là 0,5mM.
3.3.3 Ảnh hưởng của thời gian nuơi cấy tới biểu hiện protein tái hợp
Trong thí nghiệm khảo sát thời gian nuơi cấy thích hợp, chủng biểu hiện được cảm ứng với 0,5 mM IPTG và nuơi cấy ở 370C. Dịch tế bào sẽ được thu ở các
1 2 3 4 5 6 116 116 66,2 45,0 35,0 kDa 36kDa 45 35 45,0 35,0
Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
thời điểm khác nhau: 0, 1, 2, 3, 4, 5 giờ và kiểm tra protein tổng số trên gel polyacrylamide để xác định thời gian thích hợp cho việc thu nhận protein tái tổ hợp.
Hình 3.12: Kết quả thu nhận protein tái tổ hợp ở các thời điểm khác nhau
Giếng 1: Marker protein
Giếng 2:Mẫu đối chứng 0 giờ sau cảm ứng
Giếng 3, 4, 5, 6: Mẫu thu được tại các thời điểm 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ, 4 giờ sau cảm ứng tương.
Kết quả điện di cho thấy hàm lượng protein tái tổ hợp tăng dần sau 1 giờ nuơi cấy cảm ứng và đạt tối đa sau 3 giờ. Sau 4 giờ nuơi cấy sau cảm ứng thì hàm lượng protein bắt đầu giảm (hình 3.12). Lý do của hiện tượng hàm lượng protein tái tổ hợp giảm sau 4 giờ nuơi cấy chúng tơi chưa hiểu rõ, cĩ thể là do protein p24 bị phân hủy bởi protease của vi khuẩn chủ.Vì vậy chúng tơi xác định thời gian thu hồi protein tái tổ hợp tối ưu là 3 giờ sau cảm ứng IPTG.
Qua khảo sat chúng tơi đã tìm được điều kiện tối ưu cho sự biểu hiện của p24 tái tổ hợp ở 370
C, nồng độ chất cảm ứng IPTG là 0,5 mM và thu nhận protein tái tổ hợp sau 3 giờ nuơi cấy cảm ứng. Đây cũng là điều kiện nuơi cấy được chúng tơi áp dụng cho các bước nghiên cứu tiếp theo.