12 Vi khuẩn Dehalogenimonas
2.2.11. Đánh giá khả năng phân hủy các hợp chất hữu cơ chứa clo (đa) vòng thơm
2.2.11.1. Đánh giá khả năng phân hủy các chất là thành phần của chất diệt cỏ trên máy GC/MS
Thành phần của chất diệt cỏ/dioxin của mẫu nuôi cấy VK KSF được chiết theo quy trình sau: (1) Kiểm tra pH của dung dịch nuôi cấy (mẫu) bằng giấy chỉ thị pH, chỉnh đến pH ~ 7 - 8. (2) Siêu âm mẫu trong bể siêu âm khoảng 15 phút. (3) Bổ sung dichloromethane vào mẫu theo tỷ lệ 1:2 (v/v). Lắc hỗn hợp ở tốc độ lắc 300 vòng/phút trong 30 phút. Để lắng, tiếp tục lắc ở tốc độ lắc 300 vòng/phút trong 30 phút. Gạn lấy phần dung dịch và lọc lấy phần dichloromethane, để riêng. (4) Điều chỉnh pH phần dung dịch đến pH < 2 bằng H2SO4 6N. Tiếp tục bổ sung
dichloromethane và lắc như bước 3. Gạn, lọc lấy phần dichloromethane. (5) Gộp toàn bộ phần dichloromethane và làm khan bằng Na2SO4. (6) Cô đuổi dung môi trên máy cất quay đến V~0,5 ml. Chuyển phần còn lại vào ống nghiệm, làm bay hơi đến khô phần dung môi còn lại bằng dòng không khí nóng. Định mức chính xác bằng MeOH. (7) Chạy SCAN trên thiết bị Sắc ký khí khối phổ để xác định thành phần định tính mẫu nghiên cứu.
Thành phần của chất diệt cỏ/dioxin trong mẫu làm giàu VK KK hô hấp loại khử clo trên đất ô nhiễm được chiết theo quy trình sau: (1) Cân chính xác 5g đất/mẫu, chuyển vào ống chứa mẫu của bộ chiết Soxlet. (2) Chiết mẫu bằng 200 ml acetone trongvòng 8 giờ, mỗi giờ đảm bảo từ 4-6 lần dung môi tràn qua ống chứa mẫu. (3) Cô đuổi dung môi trên máy cất quay đến V~ 1ml, chuyển vào ống nghiệm nhọn đáy có chứa 50l MeOH. (4) Tiếp tục làm bay hơi dung môi dưới dòng không khí nóng đến V ~50l. Định mức bằng 0,5 ml MeOH. (5) Chạy SCAN trên thiết bị Sắc ký khí khối phổ để xác định thành phần định tính mẫu nghiên cứu.
Sau khi chiết theo các quy trình trên, các chất được xác định bằng phương pháp scanning (quét) trên máy GS7809A/MSD 5975C theo chương trình sau: Nhiệt độ đầu 60C (giữ 1 phút), tăng 8C/phút đến 320C (giữ ở nhiệt độ này từ 5 phút).
Nhiệt độ Injector: 280C, Interface: 280C. Bơm 1l dung dịch mẫu theo kiểu không chia dòng (Splitless). Detectơ hoạt động theo chế độ quét (SCAN) từ 35 đến 550 amu. Cột phân tích DB5-MS (60m x 250m x 0,25m). Xác nhận các sản phẩm căn cứ vào thư viện phổ - cấu trúc NIST 98. Các mẫu này được phân tích tại phòng phân tích dioxin – trung tâm Nhiệt đới Việt Nga.
2.2.11.2. Đánh giá khả năng phân hủy các đồng phân dioxin trong mẫu làm giàu trên máy GC/MS
Đất từ mẫu nuôi cấy làm giàu VK KK và mẫu đối chứng sấy khô đến khối lượng không đổi. Mẫu đất được phân tích xác định nồng độ 17 đồng loại độc của dioxin/furan theo phương pháp EPA 8280 đã được cải biến. Cụ thể, mẫu được thêm các chất chuẩn nội đánh dấu đồng vị 13C12-PCDD/PCDF (EDF-2520), chiết soxhlet
với toluene. Dung dịch chiết được thêm chất chuẩn đánh dấu đồng vị 37Cl4-2,3,7,8- TCDD; làm sạch lần lượt bằng các dung dịch H2SO4 đặc, NaCl, KOH, NaCl; làm sạch trên “cột đa lớp” chứa silicagen, silicagen tẩm axít, silicagen tẩm kiềm. Phân đoạn PCDD/PCDF được tách trên cột than hoạt tính chuyên dụng, cột nhôm ôxít, thêm các chất chuẩn đánh dấu đồng vị 13C12-PCDD. Xác định hiệu suất thu hồi sau đó phân tích trên thiết bị GC 7890A/MSD 5975C của Agilent (Mỹ). Xử lý số liệu.
Nồng độ độc tương đương 2,3,7,8-TCDD là tổng tích số nồng độ mỗi chất với hệ số độc tương ứng theo quy ước năm 1998 của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đối với người. Tính nồng độ độc tương đương theo công thức sau:
Trong đó:
TEQ: nồng độ độc tương đương 2,3,7,8-TCDD
CPCDDi: nồng độ các chất độc của polyclodibenzo-p-dioxin CPCDDi: nồng độ các chất độc của polyclodibenzofuran
2.2.11.3. Xác định 2,4,5-T và 2,4-DCP trên máy HPLC
Sau 9 và 12 tuần làm giàu các VK KK trên môi trường khoáng M204, các mẫu được lấy dịch ra, ly tâm lấy sinh khối để tách DNA. Phần dịch lọc được giữ ở -20oC để phân tích hàm lượng 2,4,5-T và 2,4-DCP tương ứng. Trước khi phân tích, mẫu được làm ấm ở 37oC trong 5 phút, quy trình xác định tiếp theo như sau:
(i). Xác định 2,4-DCP và sản phẩm chuyển hóa 2-chlorophenol (2-CP) và 4- chlorophenol (4-CP): chuyển 500 µM mẫu vào lọ lấy mẫu tự động (autosample vial), 4-DCP và 4-CP được thôi khỏi cột trong methanol:H2O (65:35 hoặc 60:40%, v/v) ở 210 nm, trong 10 phút. Thời gian lưu của mẫu được so sánh với thời gian lưu 4,25; 4,59 và 8 phút của các chất chuẩn tương ứng đã biết 2-CP, 4-CP và 2,4-DCP.
(ii). Xác định 2,4,5-T và 2,4,5-trichlorophenol (2,4,5-TCP): chuyển 600 µl mẫu vào lọ lấy mẫu tự động màu nâu có chứa 150 µl acetonitrile và 50 M 4-chloro-2 methyl-phenoxy acetic acid (MCPA, chất nội chuẩn). Điều kiện tối ưu cho phân tích HPLC để xác định các hợp chất 2,4,5-T và 2,4,5-TCP là 0% acetonitrile (isocratic, 5
C TEFi C TEFi
phút), 0-50% acetonitrile (linear, 5 phút), 50% acetonitrile (isocratic, 20 phút), 50- 0% acetonitrile (linear, 6 phút) (Rice, 2005). Xác định độ hấp thụ của các hợp chất ở bước sóng 210 nm. Thời gian lưu của mẫu được so sánh với thời gian lưu 16,7; 19 và 21,2 phút của các chất chuẩn tương ứng đã biết MCPA, 2,4,5-T và 2,4,5-TCP.
Các hợp chất được định lượng dựa trên đường chuẩn với 4 nồng độ 12,5; 25; 50 và 100 µM. Phân tích thành phần và hàm lượng các chất hữu cơ chứa clo được thực hiện trên máy HPLC VWRTM Hitachi Elite LaChrom (tại phòng thí nghiệm VSV, Đại học Halle, Đức) sử dụng cột C18 (LiChrospher, 250 x 4 mm, 5 µm), tốc độ dòng là 1 ml/phút, nhiệt độ 30oC.