- Mẫu làm giàu trên đất ô nhiễm
1 VK hô hấp loại khử clo bắt buộc
bắt buộc
Dehalococcoides + + +
2 Dehalogenimonas + KPH KXĐ
3
VK hô hấp loại khử clo không bắt buộc Geobacter + KXĐ KXĐ 4 Desulfotomaculum + + + 5 Desulfitobacterium + + KXĐ 6 Desulfovibrio + + + 7 Sulfurospirillum + KXĐ KXĐ 8 Desulfococcus + + + 9 Desulfuromonas + KXĐ KXĐ 10 Anaeromyxobacter + KXĐ KXĐ 11 VK loại khử clo đồng trao đổi chất Pseudomonas + KXĐ KXĐ 12 Clostridium + KXĐ KXĐ 13 Bacillus + KXĐ KXĐ 14 Shewanella + KXĐ KXĐ 15 Dechloromonas + KXĐ KXĐ 16 Enterobacter + KXĐ KXĐ 17 Methanosarcina + KXĐ KXĐ 18 Escherichia + KXĐ KXĐ 19 Helicobacter + KXĐ KXĐ 20 Desulfobacterium + KXĐ + 21 VK đã được xác định có mặt trong lô xử lý ở Biên Hòa bằng DGGE (Đào Thị Ngọc Ánh, 2013) Bacteroides + KXĐ KXĐ 22 Deinococci + KXĐ KXĐ 23 Achromobacter + KXĐ KXĐ 24 Klebsiella + KXĐ KXĐ 25 Methylobacterium + KXĐ KXĐ
Kết quả trình bày trên Bảng 3.7 một lần nữa khẳng định công cụ Metagenomics đã đánh giá được đầy đủ các VK có mặt trong mẫu mà các phương pháp như nested-PCR và DGGE không phản ánh hết được. Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu còn phụ thuộc vào chất lượng và số lượng DNA của cả quần xã VSV có trong mẫu. Ngoài ra, dựa vào đặc điểm trao đổi chất, các VK trong mẫu làm giàu còn được chia thành 3 nhóm là VK hiếu khí, VK KK bắt buộc và kỵ khí tùy tiện (Bảng 3.8). Các VK trên chiếm tỷ lệ khác nhau trong metagenome nhưng chúng có liên quan đến quá trình loại khử các hợp chất chứa clo và phân hủy các hợp chất vòng thơm.
Bảng 3.8. Phân loại VK có mặt trong mẫu làm giàu theo khả năng hô hấp
STT VK hiếu khí Tỷ lệ (%) VK KK bắt buộc Tỷ lệ (%) VK KK tùy tiện Tỷ lệ (%)
1 Pseudomonas 59,77 Bacteroides 2,73 Prevotella 0,53
2 Azotobacter 1,98 Geobacter 2,45 Vibrio 0,48
3 Bordetella 0,78 Anaerolinea 1,26 Klebsiella 0,34
4 Comamonas 0,53 Parabacteroides 1,06 Azoarcus 0,31
5 Burkholderia 0,46 Clostridium 0,99 Porphyromonas 0,31
6 Bacillus 0,44 Desulfitobacterium 0,26 Aeromonas 0,29
7 Xanthomonas 0,44 Desulfotomaculum 0,29 Shewanella 0,29
8 Achromobacter 0,43 Pelobacter 0,27 Pelotomaculum 0,27
9 Acidovorax 0,22 Dechloromonas 0,22 Treponema 0,27
10 Streptomyces 0,22 Paludibacter 0,2 Enterobacter 0,26
11 Geobacillus 0,19 Dehalococcoides 0,15 Roseiflexus 0,26
12 Thermus 0,15 Methanosarcina 0,1 Aromatoleum 0,24
13 Acinetobacter 0,14 Methanocaldococcus 0,1 Desulfovibrio 0,24
14 Marinobacter 0,14 Dehalogenimonas 0,07 Candidatus Solibacter 0,22
15 Rhizobium 0,14 Chlorobium 0,07 Methylobacterium 0,2
16 Dyadobacter 0,12 Chloroflexus 0,07 Lactobacillus 0,19
17 Mycobacterium 0,1 Delftia 0,17 18 Nematostella 0,1 Rhodopseudomonas 0,17 19 Alcanivorax 0,1 Ralstonia 0,15 20 Chromohalobacter 0,1 Anaeromyxobacter 0,14 21 Rhodococcus 0,03 Colwellia 0,12 22 Frankia 0,12 23 Photobacterium 0,12 24 Campylobacter 0,1 25 Eubacterium 0,1 26 Deinococcus 0,05 27 Desulfobulbus 0,03 28 Desulfohalobium 0,03 29 Desulfomicrobium 0,03 30 Desulfonatronospira 0,03 31 Desulfotalea 0,03 32 Desulfurispirillum 0,03 33 Sulfurimonas 0,03 34 Sulfurospirillum 0,03 35 Desulfococcus 0,02 36 Desulfurococcus 0,02
3.3. Sự biến động số lƣợng vi khuẩn kỵ khí trong lô xử lý tại sân bay Biên Hòa
Ngoài đa dạng về chủng loại VK KK, sự biến động về số lượng của chúng trong các lô xử lý cũng đã được khảo sát. Sự biến động về số lượng VK KK ở các lô xử lý tại Đà Nẵng đã được đánh giá trong các nghiên cứu của Đặng Thị Cẩm Hà và cộng sự (Đặng Thị Cẩm Hà, 2005, 2010a) nên trong phạm vi đề tài luận án chỉ đánh giá sự biến động số lượng của VK KK tại lô xử lý ở Biên Hòa.
3.3.1. Sự biến động vi khuẩn kỵ khí sử dụng chất diệt cỏ/dioxin trong lô xử lý
Số lượng VK KK sử dụng dioxin được đánh giá bằng cách nuôi cấy trên môi trường dịch SH có bổ sung DCĐ ở nồng độ 2% (v/v). Sự biến động số lượng VK KK sử dụng dioxin được trình bày trên Hình 3.7A.
A B
Hình 3.7. Sự biến động số lượng VK KK nói chung (A) và VK KSF (B) sử dụng chất diệt cỏ/dioxin ở lô xử lý Biên Hòa
Kết quả thu được cho thấy, số lượng VK KK sử dụng dioxin ở lô 1 tăng mạnh vào đợt thứ hai, giảm nhẹ vào đợt thứ ba và tăng nhẹ vào đợt thứ 4. Số lượng VK KK ở lô 2 ổn định hơn qua cả 4 đợt lấy mẫu với số lượng khoảng 106-107 MPN/g đất và có chiều hướng tăng nhẹ vào đợt lấy mẫu sau. Ở lô số 3, số lượng VK KK tăng nhanh vào đợt lấy mẫu thứ 2, giảm nhẹ và duy trì ổn định ở nồng độ 107
MPN/g đất. Ở lô số 4, số lượng VK KK cũng ổn định ở mức 106
-107 MPN/g đất. Số lượng VK KK có giảm nhẹ vào đợt thứ 2 và tăng nhẹ vào đợt 4. Nhìn chung, số lượng VK KK trung bình của cả 4 lô khá ổn định qua cả 4 đợt lấy mẫu với số lượng VK nằm trong khoảng 106-107 MPN/g đất.
3.3.2. Sự biến động số lượng vi khuẩn khử sulfate trong lô xử lý
Vì VK KK thuộc nhóm hô hấp loại khử clo bắt buộc và không bắt buộc luôn có số lượng lớn so với các nhóm khác, đặc biệt là nhóm VK KSF nuôi cấy được nên nghiên cứu này cũng đánh giá sự biến động của VK KSF trong các lô xử lý. Sự biến động số lượng VK KSF trong lô xử lý được đánh giá bằng cách nuôi cấy trên môi trường dịch Posgate B bổ sung DCĐ với nồng độ 2% (v/v). Kết quả về sự biến động VK KSF trong lô xử lý qua 4 đợt lấy mẫu được trình bày trên Hình 3.7B.
Số lượng VK KSF khá ổn định qua các đợt lấy mẫu và duy trì ở mức độ 104- 105 MPN/g đất. Cụ thể như sau: ở lô số 1 số lượng VK KSF tăng nhẹ ở đợt thứ 2, duy trì ổn định ở đợt 3 và 4 với nồng độ 102-103 MPN/g đất. Ở lô số 2, số lượng VK KSF tăng ở đợt thứ 2 và 3, duy trì ở mức 104
-105 MPN/g đất. Ở lô số 3, số lượng VK KSF duy trì ổn định ở 104-105 MPN/g đất. Ở lô số 4, số lượng VK KSF duy trì ở nồng độ 104
-105 MPN/g đất, tăng nhẹ ở đợt lấy mẫu thứ 3. Trung bình, số lượng VK KSF tăng từ đợt lấy mẫu 1 đến đợt 3 và giảm nhẹ ở đợt 4 (Hình 3.7B).
Như vậy, số lượng VK KK có khả năng sử dụng dioxin trong các mẫu ở lô xử lý của Biên Hòa luôn cao hơn số lượng VK KSF ở các đợt lấy mẫu. Số lượng các VK KK nói chung và VK KSF nói riêng được duy trì khá ổn định qua các đợt lấy mẫu, thường tăng nhẹ vào đợt lấy mẫu thứ 2 và ổn định vào đợt lấy mẫu thứ 3 và thứ 4.
Để xử lý triệt để các chất hữu cơ chứa clo là thành phần của chất diệt cỏ/dioxin cần có sự kết hợp của nhiều VSV. Đặc biệt, các VK KK có khả năng loại khử clo thường sống thành quần xã trong đó mỗi VK có vai trò khác nhau trong quá trình loại khử clo. Do đó, các nghiên cứu tiếp theo được thực hiện với cả quần xã VK KK (bao gồm Dehalococcoides) và quần xã VK KSF nhằm có những thông số kỹ thuật cơ bản ở mức độ chi tiết hơn để áp dụng vào quá trình xử lý cũng như nâng cao hiệu quả khử độc ở quy mô hiện trường.
3.4. Sự đa dạng một số nhóm gene chức năng tham gia vào các quá trình của tế bào
3.4.1. Sự có mặt của các gene reductive dehalogenase (rdhA) trong các lô xử lý
và trong mẫu làm giàu
Theo các tài liệu đã công bố, gene rdhA có mặt ở các VK hô hấp loại khử clo kỵ khí bắt buộc như Dehalococcoides, Dehalobacter, Desulfitobacterium. Do đó,
các mẫu được xác định có mặt VK Dehalococcoides hay Desulfitobacterium được lựa chọn để xác định sự có mặt của gene rdhA. Mặt khác, sự có mặt của các gene khác nhau ở các chủng, các chi khác nhau là khác nhau trong đó VK
Dehalococcoides là nhóm mang nhiều gene rdhA nhất. Do đó, các mẫu đã được xác định có mặt Dehalococcoides được ưu tiên nghiên cứu. Từ DNA tổng số của các mẫu đất tại các lô xử lý ở sân bay Đà Nẵng, Biên Hòa và các mẫu làm giàu VK hô hấp loại khử clo kỵ khí bắt buộc (các mẫu đã được xác định có mặt VK
Dehalococcoides như đã trình bày ở trên) được lựa chọn để nhân đoạn gene rdhA
bằng các cặp mồi khác nhau như trình bày ở Bảng 2.2.
Trong nghiên cứu này, 5 cặp mồi khác nhau đặc hiệu cho các đoạn gene chức năng rdhA khác nhau như pceA, tceA, cbrA, DET0318 (Bảng 2.2) đã được sử dụng. Tuy nhiên, với tất cả các cặp mồi sử dụng với điều kiện tối ưu cho phản ứng PCR nhưng chưa đoạn gene rdhA nào được phát hiện.
3.4.2. Sự đa dạng một số nhóm gene chức năng tham gia vào các quá trình của tế bào phát hiện bằng Metagenomics bào phát hiện bằng Metagenomics
Ngoài DNA mã hóa cho gene 16S rRNA, 23S rRNA của các VSV, trong metagenome của mẫu làm giàu còn chứa DNA mã hóa cho các thành phần protein tham gia vào các quá trình của tế bào (Hình 3.8).
Từ trình tự metagenome của mẫu làm giàu VK KK, so sánh với các trình tự hiện có trên GenBank cho thấy có 1883 gene chức năng đã được phát hiện. Các gene này được đối chiếu trên cơ sở hệ thống phụ các nhóm chức năng. Kết quả thu được cho thấy ngoại trừ các gene liên quan đến quang hợp, các protein mã hóa bởi các gene chức năng phát hiện được tham gia vào hầu hết các chu trình tế bào với mức độ khác nhau (Hình 3.8).
Danh sách các enzyme được mã hóa bởi các gene liên quan đến quá trình chuyển hóa các hợp chất vòng thơmcó mặt trong mẫu làm giàu được trình bày ở Bảng 3.9.
Bảng 3.9. Các enzyme được mã hóa bởi các gene tham gia vào quá trình phân hủy và chuyển hóa các hợp chất vòng thơm
STT Quá trình phân hủy Hợp chất Enzyme