Đối t−ợng vμ ph−ơng pháp nghiên cứu 2.1 Đối t−ợng
2.2.Ph−ơng pháp và kỹ thuật nghiên cứu
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu
Là một nghiên cứu mô tả nhằm mô tả sự thâm nhiễm của các tế bào có thẩm quyền miễn dịch tại mô bệnh và sự biểu lộ MHC lớp 1 trên bề mặt tế bào biểu mô ung th− tại khối u với thể mô bệnh học là ung th− biểu mô
không biệt hoá, tìm DNA của EBV tại máu ngoại vi trên bệnh nhân UTVMH tr−ớc và sau điều trị.
2.2.2. Mẫu nghiên cứu
Cỡ mẫu đ−ợc tính theo công thức sau [31], [32]: pq
n = Z2(1-∝/2) --- d2 Trong đó:
n : Cỡ mẫu
Z(1-∝/2) : Hệ số tin cậy ở mức xác suất 95% p : Tỷ lệ −ớc l−ợng có MHC (+) là 50% q : Tỷ lệ −ớc l−ợng có MHC (-) là 50%
d : Độ chính xác mong muốn =14%
Cỡ mẫu cho nghiên cứu này là 49 bệnh nhân. Trên thực tế tôi nghiên cứu đ−ợc 57 bệnh nhân.
2.2.3. Kỹ thuật nghiên cứu
Bao gồm một số kỹ thuật sau:
- Phỏng vấn bệnh nhân nhằm thu thập các thông tin cá nhân nh− tuổi, giới; khám lâm sàng để xác định giai đoạn bệnh.
- Hoá mô miễn dịch: xác định các tế bào thâm nhiễm trong khối u VMH (TCD4, TCD8, NK) và biểu lộ MHC lớp I.
- PCR (phản ứng khuyếch đại chuỗi): tìm EBV ở tế bào lympho máu ngoại vi.
Xác định sự biểu lộ MHC lớp I, tiến hành tại bộ môn Miễn dịch - Sinh lý bệnh, Đại học Y Hà Nội.
Nguyên lý kỹ thuật: là một kỹ thuật đánh dấu bằng huỳnh quang nhờ tính chất phát quang của chất huỳnh quang gắn với kháng thể. Khi kháng thể này kết hợp với kháng nguyên (phân tử MHC lớp I ) đ−ợc cố định trên tiêu bản. D−ới ánh sáng tia cực tím ta có thế phát hiện đ−ợc một cách dễ dàng sự kết hợp kháng nguyên - kháng thể trên tiêu bản qua kính hiển vi huỳnh quang mà mắt th−ờng và kính hiển vi quang học thông th−ờng không phát hiện đ−ợc.
Các b−ớc tiến hành:
B−ớc 1:
ắ Chuẩn bị: mô sinh thiết ung th− vòm đ−ợc bảo quản ở nhiệt độ - 200 C không quá 72h.
ắ Xử lý mẫu sinh thiết: mẫu sinh thiết đ−ợc cắt thành những lát mỏng bằng kỹ thuật cắt lạnh thực hiện tại khoa Giải phẫu bệnh, bệnh viện K bằng máy Cryotome của hãng Shandon.
ắ Mẫu sinh thiết đ−ợc đặt vào giá đặt bệnh phẩm, mặt cắt theo chiều dày của mô UTVMH phải đ−ợc đặt song song với mặt giá để bệnh phẩm, sau đó rỏ lên 1 vài giọt paraffin dạng gel rồi đặt vào trong máy cắt lạnh ở vị trí tăng đông để làm đông lạnh.
ắ Khi mẫu bệnh phẩm đã đạt đ−ợc độ đông lạnh ở -220 C đến -300 C thì tiến hành đ−a giá có mẫu bệnh phẩm vào vị trí cắt của máy.
ắ Điều chỉnh thông số độ dày của lát cắt từ 4-6 μm (bằng chiều dày của một tế bào, nếu lớp cắt quá dày thì các lớp tế bào sẽ chồng lên nhau gây khó khăn khi nhuộm và nhận định kết quả). Bỏ những lát cắt đầu cho đến khi đạt đ−ợc hết chiều dày của mô sinh thiết. Lát cắt đ−ợc trải dài trên nhiều lam kính và đ−ợc bảo quản trong tủ lạnh chuyên dụng có độ lạnh tối đa -700 C và nhuộm tr−ớc 72 h.
ắ Lấy một tiêu bản nhuộm Gemsa để khẳng định đây là tổ chức UT B−ớc 2: Tiến hành nhuộm
ắ Cố định tiêu bản bằng acéton lạnh trong 5’. ắ Rửa tiêu bản 2 lần bằng PBS (pH = 7,4). ắ Hong khô tiêu bản trên giá.
ắ Rỏ KT đơn dòng chống MHC lớp I (locus A và B) lần l−ợt theo quy trình đã quy chuẩn.
ắ ủ ấm tiêu bản ở nhiệt độ 37 0C trong 30’. ắ Loại bỏ KT thừa bằng PBS 3 lần, để khô.
ắ Tiêu bản đ−ợc ủ với anti mouse IgG gắn huỳnh quang ở độ pha loãng 1/ 20.
ắ ủ ấm tiêu bản ở nhiệt độ 37 0 C trong 45’. Loại bỏ KT thừa bằng PBS 3 lần, để khô. Rỏ glycérin, phủ lamen lên trên và đọc tiêu bản d−ới kính hiển vi huỳnh quang.
B−ớc 3: Nhận định kết quả (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
ắ Âm tính: tất cả các tế bào trong lát cắt không phát quang và có màu đỏ.
ắ D−ơng tính: khi có các tế bào bắt màu xanh lục. Tùy theo số l−ợng tế bào phát quang mà chia ở các mức độ khác nhau.
(+): d−ơng tính yếu (++): d−ơng tính vừa
(+++): d−ơng tính mạnh
2.2.3.2. Kỹ thuật hóa mô miễn dịch:
Xác định sự thâm nhiễm của các tế bào TCD4, TCD8, NK và sự biểu lộ MHC lớp I tại mô ung th−, tiến hành tại khoa Giải phẫu bệnh - Bệnh viện K Hà Nội.
Nguyên lý: sử dụng kháng thể đơn dòng gắn Biotin chống các phân tử KN có trên bề mặt tế bào lympho TCD4, TCD8, NK ở mô UVMH. Phát hiện phức KN- KT bằng stropta và dùng PO kháng Biotin và phát hiện màu bằng DAB.
Sơ đồ 2.1: Kỹ thuật hoá mô MD
Các b−ớc tiến hành:
B−ớc 1: Chuẩn bị
- Các tiêu bản đ−ợc cắt mỏng 4-5 μm
- Lấy một tiêu bản nhuộm Gemsa để khẳng định đây là tổ chức UT
- Nhuộm hóa mô miễn dịch với KT đơn dòng kháng phần tử CD4, CD8, CD56.
- Kháng thể đơn dòng sử dụng trong nghiên cứu là kháng thể của hãng Dako.
B−ớc 2: Tiến hành nhuộm:
- Khử peroxidase nội sinh bằng dung dịch H2O2 / methalnol 2 lần / 2 phút (kiểm tra trên kính hiển vi quang học không thấy còn màu vàng nhiễm trên tiêu bản).
- Bộc lộ KN (phân tử CD4, CD8, CD56 ...)
- Để tiêu bản nguội dần rồi nhúng vào một cốc n−ớc cất 2 lần / 2 phút.
- Rửa tiêu bản bằng dung dịch Tris-Buffer-Saline (TBS) pH = 7,6 / 5 phút.
- Khử các protein không đặc hiệu bằng Bovine-Serum-Albumine / 5 phút.
- Phủ kháng thể thứ nhất (KT đơn dòng) có gắn Biotin trong 60 phút.
- Rửa tiêu bản bằng dung dịch TBS 2 lần / 5 phút.
- Phủ kháng thể thứ 2 (streptavidin )
- Sau khi tiêu bản khô, nhỏ cơ chất phát hiện DABs trong 30 phút.
- Rửa tiêu bản bằng TBS 2 lần / 5 phút
- Nhuộm nhóm tế bào bằng Hematoxiline trong 1phút
- Khử n−ớc và làm lạnh tiêu bản bằng cách chuyển tiêu bản lần l−ợt qua cồn
76 0, cồn 96 0, cồn 100 0 I, cồn 100 0 II, Xylen I, Xylen II.
- Đọc tiêu bản d−ới kính hiển vi quang học B−ớc 3: Đánh giá kết quả:
- Bán định l−ợng: dựa vào phần trăm số l−ợng tế bào d−ơng tính (tế bào bắt màu nâu) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 2.1: Đánh giá mức độ tế bào (+) bằng ph−ơng pháp bán định l−ợng
Mức độ 0 (+) (++) (+++)
Số tế bào d−ơng tính < 25% 25-50% 50-75% > 75%
2.2.3.3. Ph−ơng pháp đo màu:
Phát hiện sự biểu lộ MHC lớp I, các tế bào CD4, CD8, CD56 tại mô ung th−, tiến hành tại bộ môn Mô phôi, Đại học Y Hà Nội.
Các tiêu bản đã đ−ợc nhuộm bằng ph−ơng pháp HMMD đọc kết quả, giữ nguyên mã số tiếp tục đ−ợc kiểm tra bằng ph−ơng pháp thứ hai - thông qua một ch−ơng trình nhận dạng màu đã đ−ợc thiết kế sẵn với các thông số sau:
- Độ phóng đại 100 lần
- ánh sáng 3
- thời gian lộ sáng: 35’’ - gain 4
- cân bằng trắng, phân đoạn ảnh: tự động. - Sử lý số liệu SPSS.
Các thông số đ−ợc xác định cho từng loại tế bào theo kết hợp KN - KT đặc hiệu bao gồm:
- N - là số vùng đ−ợc đo trên tiêu bản
- Mean - là giá trị trung bình (x) của các vùng đã đo
- SD - là độ lệch chuẩn của các vùng đã đo
- Min - là giải vùng màu thấp nhất
- Max - là giải vùng màu cao nhất
Giải vùng màu biến đổi từ 0 (màu đậm) đến 255 (màu nhạt )
2.2.3.4. Phản ứng khuyếch đại chuỗi (PCR):
Phát hiện DNA của EBV ở tế bào lympho máu ngoại vi.
Nguyên lý: Sử dụng kỹ thuật Nested PCR để phát hiện DNA của EBV bằng cặp mồi đặc hiệu.
B−ớc 1: Chiết tách DNA từ bạch cầu máu ngoại vi theo ph−ơng pháp của Miller và cộng sự [101].
B−ớc 2: Phát hiện DNA của EBV bằng kỹ thuật Nested PCR theo ph−ơng pháp của Tsai [117] và cộng sự:
-Làm PCR lần 1 với cặp mồi Pm sản phẩm thu đ−ợc Pd=479 bp.
-Sau khi chạy điện di kiểm tra, thấy chắc chắn có sản phẩm
Pd=479 bp, sản phẩm này sẽ đ−ợc dùng làm mẫu để tiến hành PCR lần 2.
-Làm PCR lần II với cặp mồi Pm’, sản phẩm thu đ−ợc Pd’=285 bp.
-Sau khi làm lần II, chạy điện di kiểm tra thấy có sản phẩm Pd’=285 bp, kết luận mẫu thử có DNA của EBV (+).
Kỹ thuật này đ−ợc thực hiện tại Đại học Y Aichi, Nagakute 480-1195 Nhật Bản.
Bảng 2.2: Các cặp mồi để xác định EBV- ADN [90]
Pm 5’ – GTTCGCGTTGCTAGGCCACC – 3’ 5’ – GACCGGTGCCTTCTTAGG – 3’ Pm’ 5’ – CCCTGGTATAAGTGGTCCT – 3’ 5’ – AAGTCCACTTACCTCTGG – 3’ Pd Pd’ 479 bp 285 bp (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});