3.4.1. Môi trƣờng tạo cảm ứng cụm phôi soma của phôi trục hạt lạc
Tái sinh thông sự hình thành phôi soma đã được tiến hành thực nghiệm ở nhiều loài thực vật bao gồm cả lạc. Cho đến nay nhiều loại mô cấy đã được sử dụng để cảm ứng phôi soma ở lạc, bao gồm: Lá của cây non [22], [82]; phôi non hạt lạc [60], phôi trục [14], [77]; lá chét của phôi trục [34], [77], [84]; trụ dưới lá mầm [83]... Các báo cáo đều đưa ra một kết luận rằng khả năng cảm ứng phôi soma của mẫu mô cấy chịu ảnh hưởng lớn của nồng độ 2,4-D.
Phôi trục của hai giống lạc sau khi được tách ra từ hạt đã khử trùng (mục 2.2.1.1) và ngâm trong nước cất vô trùng 12-16h sau đó được khử trùng lại một lần nữa bằng thủy ngân clorua 0,1% trong 3 phút, tráng sạch từ 4 - 5 lần bằng nước cất khử trùng rồi cấy trên môi trường tiền cảm ứng phôi soma PM (bảng 2.2) có chứa nồng độ khác nhau của 2,4-D (0-30 mg/l) để cảm ứng phôi soma (sử dụng 50 phôi/ mỗi công thức thí nghiệm). Theo dõi khả năng cảm ứng phôi soma sau khi nuôi 1 tuần trong tối và 5 tuần dưới ánh sáng đèn phòng nuôi cấy, chúng tôi thu được kết quả ở bảng 3.9.
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của nồng độ khác nhau của 2,4-D đến khả năng cảm ứng tạo phôi soma của các giống lạc
2,4-D (mg/l) L23 L26 Tỷ lệ cảm ứng phôi (%) Số phôi soma TB/ mẫu cấy Tỷ lệ cảm ứng phôi (%) Số phôi soma TB/ mẫu cấy 0 0 0 0 0 10 80,7 ± 3,05 11,8 ± 0,22 76,0 ± 2,0 10,3 ± 0,32 20 91,3 ± 1,16 16,7 ± 0,28 86,7 ± 3,05 14,3 ± 0,32
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
51
30 73,3 ± 1,16 6,2 ± 0,32 67,3 ± 2,31 7,7 ± 0,22
Kết quả thể hiện trong bảng 3.9 cho thấy ở môi trường cảm ứng không có 2,4-D phôi trục đã không có sự cảm ứng tạo phôi soma, trong khi môi trường có 2,4-D ở các mức 10, 20 và 30mg/l thì đã cảm ứng phôi ở cả 2 giống thử nghiệm, tỷ lệ cảm ứng phôi soma của phôi trục cao nhất ở môi trường 2,4-D có nồng độ 20mg/l là 91,3% (đối với giống L23) và 86,7 (đối với giống L26). Tần số cảm ứng phôi soma giảm khi nồng độ 2,4-D tăng lên 30mg/l 2,4-D.
Trên môi trường cảm ứng có 2,4-D và được ủ trong tối 7 ngày, phôi trục cảm ứng rất mạnh bằng việc nhanh chóng tăng sinh khối (kích thước khoảng 4 x 4 x 3 mm) và có màu vàng không nhớt. Tiếp tục ủ 5 tuần ngoài sáng, phôi trục chuyển sang màu xanh và xuất hiện cụm tế bào phôi soma được quan sát thấy hình thành từ khu vực mô phân sinh bên và phần tiếp giáp giữa chồi đỉnh với trụ dưới lá mầm của phôi trục (hình 3.9). McKently (1991) nuôi cấy phôi trục của lạc cũng nhận thấy sự hình thành, phát triển phôi soma bắt nguồn từ một vùng 2mm của mô trụ dưới lá mầm xung quanh chồi đỉnh của phôi trục [55]. Các phôi cảm ứng được cấy chuyển sang môi trường phát triển EM (bảng 2.2) chứa 3mg/l 2,4-D trong 4 tuần để tiếp tục phát triển cụm phôi và thúc đẩy sự trưởng thành của các phôi soma (hình 3.10 (A)). Số phôi soma trung bình được tạo ra sau 4 tuần trên môi trường phát triển ở mỗi cụm cũng được trình bày ở bảng 3.9.
A B
Hình 3.9. Vùng phôi trục có khả năng cảm ứng phôi soma sau khi ủ trên môi trường tiền cảm ứng phôi soma (PM) chứa 20mg/l 2,4-D (mũi tên)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
52 A - Phôi trục hạt lạc trước khi cảm ứng
B - Phôi trục cảm ứng phôi soma sau 6 tuần ủ trên môi trường cảm ứng PM
Kết quả trong bảng 3.9 cho thấy số phôi soma được tạo ra cao nhất là 16,7 phôi (20mg/l 2,4-D) trên một phôi trục ban đầu và thấp nhất là 6,2 phôi (30mg/l 2,4-D) đối với giống L23, còn trên giống L26 số phôi soma được tạo ra cao nhất là 14,3 phôi (20mg/l 2,4-D) và thấp nhất là 7,7 phôi (30mg/l 2,4-D). Ở nồng độ cao 2,4-D (30mg/l) phôi trục xuất hiện nhiều mô sẹo màu nâu hoặc đen không có khả năng tạo phôi soma mà chỉ tăng dần kích thước trong quá trình nuôi cấy về sau nên đã ảnh hưởng đến số lượng phôi soma được hình thành. Kết quả ở bảng 3.9 còn cho thấy khả năng cảm ứng phôi soma và số phôi soma được tạo thành trên một mẫu cấy là khác biệt nhau giữa hai giống. Các tác giả Singh và Hazra (2009) khi nghiên cứu sự phát triển của cụm phôi soma hình thành từ lá chét và mô phân sinh nách phôi trục hạt lạc trên các môi trường phát triển có bổ sung 2,4-D đã báo cáo rằng tỷ lệ cảm ứng phôi soma thu được tốt nhất là khi ủ chúng trên môi trường có bổ sung 20mg/l 2,4-D và thời gian ủ trong 6 tuần là tốt nhất cho sự phát triển bình thường về sau này của phôi soma. Tác giả cũng báo cáo môi trường 2,4-D nồng độ 3mg/l đã thúc đẩy sự phát triển và trưởng thành của phôi soma tốt hơn so với môi trường phát triển không có 2,4-D và môi trường có 2,4-D với nồng độ cao (20mg/l); số phôi soma được hình thành cao nhất là 3,0 phôi/ 1 lá chét và 7,5 phôi/mô phân sinh nách [77]. Kết quả của chúng tôi và kết quả của các tác giả Singh và Hazra (2009) có sự khác nhau cho thấy cùng một quy trình nhưng mỗi giống, mỗi loại mô cấy khác nhau đã phản ứng cho một kết quả cụ thể khác nhau. Trong báo cáo của Bùi Văn Thắng và cs (2004) cũng cho thấy đã tạo được hệ số phôi soma trên một cụm phôi là 13,6 phôi sau khi ủ phôi trục 4 tuần trên môi trường bổ sung 20mg/l 2,4-D [14].
Các phôi soma có kích thước 1,5-3,0 mm có thể quan sát bằng mắt thường, chúng có nhiều hình dạng khác nhau nhưng nhìn chung có hai dạng chính là phôi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
53
soma đơn lẻ và phôi soma đính chung phần rễ mầm cùng hình thành trên một cụm phôi soma (Hình 3.10B). Trong quá trình nuôi cấy phát triển cụm phôi soma thấy xuất hiện một số phôi nảy mầm mọc lá non điều đó cho thấy các phôi soma phát triển không đồng đều, các giai đoạn phát triển của các phôi soma cùng diễn ra đan xen trên cùng môi trường phát triển cụm phôi soma (Hình 3.10A).
A B
Hình 3.10. Phôi soma trưởng thành với lá mầm và rễ mầm đầy đủ
A - Phôi soma trưởng thành với lá mầm nổi trên bề mặt cụm tế bào phôi sẹo sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường phát triển EM
B - Các phôi soma đơn lẻ và các phôi soma dính nhau ở phần rễ mầm (mũi tên) cùng hình thành trên một cụm phôi soma (L23)
3.4.2. Môi trƣờng tái sinh cây từ phôi soma
Thông thường, phôi soma được tạo ra dù bằng phương pháp trực tiếp hay gián tiếp đều đòi hỏi phải có môi trường riêng cho sự nảy mầm [55]. Trong thí nghiệm của chúng tôi, các phôi soma được tách khỏi cụm phôi và cấy chuyển sang môi trường nảy mầm SM (bảng 2.2) để nghiên cứu khả năng tái sinh cây từ cụm phôi soma (Hình 3.11A). Môi trường nảy mầm phôi soma có thể không có chất điều hòa sinh trưởng hoặc có bổ sung với các nồng độ khác nhau của BAP hoặc
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
54
tổ hợp của BAP với NAA để tái sinh phôi soma thành cây con. Tỷ lệ tái sinh cây được xác định sau 8 tuần được thể hiện trong Bảng 3.10.
Kết quả ở bảng 3.10 cho thấy sự hình thành cây từ các phôi soma bị ảnh hưởng đáng kể bởi tác động của BAP. Tỷ lệ tái sinh thành cây ở 2 giống dao động trong khoảng 10,0-10,6% trên môi trường không có chất điều hòa sinh trưởng. Tuy nhiên với sự bổ sung 0,3 mg/l BAP vào môi trường nảy mầm được quan sát thấy là có hiệu quả nhất để kích hoạt phôi soma nảy mầm (tỷ lệ tái sinh thành cây của 2 giống dao động từ 34,7-36%). Các phôi soma nảy mầm hình thành chồi non sau 4 – 8 tuần (Hình 3.11B, C) và chồi được kéo dài sau 12 tuần trên môi trường nảy mầm phôi SM (Hình 3.11D, E).
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của BAP và tổ hợp BAP với NAA đến khả năng tái sinh thành cây của phôi soma (%) sau 8 tuần
BAP NAA Số phôi
soma thí nghiệm Tỷ lệ tái sinh (%) (mg/l) L23 L26 0 0 60 10,0 ± 2,89 10,6 ± 1,93 0,1 0 60 28,9 ± 0,96 32,2 ± 1,93 0,3 0 75 36,0 ± 1,33 34,7 ± 1,33 0,5 0 75 31,6 ± 0,77 28,4 ± 1,54 0,1 0,05 75 15,1 ± 1,54 18,2 ± 2,04 0,3 0,05 75 16,9 ± 1,54 19,1 ± 1,54 0,5 0,05 75 24,4 ± 1,54 28,4 ± 2,04 A B C
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
55
D E F
Hình 3.11. Phôi soma tái sinh trên môi trường nảy mầm có chứa 0,3mg/lBAP (A) - Phôi soma (giống lạc L23) được tách ra và cấy lên môi trường nảy mầm SM (B) - Phôi soma phát triển và bắt đầu nảy mầm sau 4 tuần nuôi cấy
(C) - Phôi soma tái sinh thành cây con sau 8 tuần nuôi cấy (D), (E) – Cây tái sinh với rễ còi cọc sau 12 tuần nuôi cấy
(F) - Tương quan kích thước của phôi trước và sau khi nảy mầm
Trong báo cáo của Shweta Singh (2009), khi tái sinh cây từ phôi soma được hình thành từ mô phân sinh của phôi trục đã thu được tỷ lệ 32% cây tái sinh hoàn chỉnh trên môi trường nảy mầm không có chất điều hòa sinh trưởng. Tuy nhiên tác giả đã không thử nghiệm tái sinh cây trên môi trường nảy mầm có bổ sung cytokinin hoặc cytokinin kết hợp với các chất thuộc nhóm auxin để nghiên cứu ảnh hưởng của chúng đến khả năng tái sinh cây từ phôi soma. Trong kết quả nghiên cứu của chúng tôi, mặc dù tỷ lệ tái sinh cây từ phôi soma trên môi trường nảy mầm không có chất điều hòa sinh trưởng là thấp hơn so với kết quả thu được trong báo cáo của Shweta Singh (2009) (điều này xảy ra có thể do sự khác biệt di truyền của các giống nghiên cứu cho nên mỗi giống có một mức đáp ứng riêng trên cùng một quy trình thí nghiệm), nhưng khi bổ sung BAP (0,3mg/l) vào môi trường nảy mầm đã làm tăng tỷ lệ tái sinh cây từ phôi soma một cách đáng kể từ 10,0% lên 36% (đối với giống L23) và từ 10.6% lên 34,7% (đối với giống L26).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
56
Điều này cho thấy quá trình nảy mầm của phôi soma ở hai giống lạc được nghiên cứu chịu sự điều khiển, tác động lớn từ BAP.
Khi so sánh kết quả tái sinh phôi soma trên môi trường không có chất kích thích sinh trưởng với kết quả của Bùi Văn Thắng và cs (2004) chúng tôi nhận thấy tỷ lệ tái sinh phôi soma đạt 10% ở giống L23 và 10,6% ở giống L26 trong thí nghiệm của chúng tôi là cao hơn so với 1,4% ở giống MD7 trong thí nghiệm của tác giả. Điều này cho thấy ngoài ảnh hưởng của giống thì hiệu quả của thời gian ủ ban đầu của mẫu cấy trên môi trường cảm ứng phôi soma (20mg/l 2,4-D) cũng có thể quyết định đến tỷ lệ phôi phát triển bình thường được hình thành sau này. Thời gian ủ mẫu cấy trên môi trường cảm ứng phôi soma trong thí nghiệm của chúng tôi là 6 tuần còn trong thí nghiệm của tác giả Bùi Văn Thắng và cs (2004) là 4 tuần.
Trong quá trình nuôi cấy của chúng tôi, sự phát sinh phôi soma dị thường cũng đã xảy ra (hình 3.12 (A)) và nó cũng là một trong những vấn đề chính trong việc tái sinh thông qua phôi soma mà một số tác giả đã đề cập đến từ trước đây [14], [36]. Nguyên nhân dẫn đến hiện tượng dị thường của phôi soma có thể do kết quả của biến dị soma trong quá trình phôi hóa trên môi trường chứa nồng độ cao của 2,4-D (20mg/l) [14]. Tuy nhiên, phôi vẫn có thể được phục hồi khả năng phát triển bình thường [34], [36]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, phôi soma phát triển dị thường cũng đã thể hiện sự tái sinh trên môi trường nảy mầm SM có bổ sung 0,5 mg/l BAP (hình 3.13), tuy nhiên, sự phục hồi cũng chỉ đạt được ở mức thấp ở cả hai giống lạc (dưới 15%) (hình 3.12). Tác giả Chengalrayan (1997) đã thu được kết quả là 92% cây được phục hồi từ phôi soma có hình thái bất thường khi bổ sung TDZ trong môi trường MS cơ bản và để cho rễ phôi soma tiếp xúc với TDZ, cây phục hồi có hình thái rễ còi cọc và chồi có lá không mở rộng hoàn toàn [36]. Tác giả Bùi Văn Thắng và cộng sự (2004) sau khi sử dụng tổ hợp 2,0mg/l BAP và 3,0mg/l KN cũng đã phục hồi thành công 82% các phôi soma nảy mầm bị dị thường [14]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, sự tái sinh của phôi soma phát triển dị thường chỉ đạt tỷ lệ thấp (dưới 15%) có thể do môi trường nảy mầm chỉ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
57
được bổ sung một lượng cytokinin không đáng kể (0,5mg/l BAP) nên không đủ kích thích các phôi dị thường nảy mầm với tần số cao, trong khi đó tác giả Bùi Văn Thắng và cộng sự đã sử dụng kết hợp tới 2 loại cytokinin với nồng độ cao hơn rất nhiều để phục hồi phôi dị thường [14].
A B C
Hình 3.12. Phôi soma phát triển dị thường mọc lá thật trên môi trường nảy mầm SM (A) - Phôi soma phát triển dị thường
(B), (C) - Phôi phát triển dị thường mọc chồi và lá thật trên môi trường nảy mầm SM (0,5mg/l BAP) sau 8 tuần nuôi cấy
3.4.3. Khả năng ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh từ phôi soma
Quá trình tái sinh chồi từ phôi soma chịu sự điều khiển của BAP - một chất thuộc nhóm cytokinin nên bộ rễ của cây bị còi cọc, kém phát triển (hình 3.11 (E), do đó để phát triển bộ rễ hoàn chỉnh cần cấy chuyển cây non qua môi trường ra rễ (RM) chứa NAA nồng độ 0,3mg/l. Kết quả thu được sau 4 tuần nuôi cấy cho thấy, trên môi trường có chứa NAA tỷ lệ tạo rễ là 98% (đối với giống L23) và 96% (đối với giống L26) cao hơn rất nhiều so với môi trường không bổ sung NAA (10%).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
58
Hình 3.13. Cây tái sinh từ phôi soma với bộ rễ hoàn chỉnh
3.4.4. Nhận xét về môi trƣờng tái sinh cây lạc từ phôi soma
(1) Môi trường thích hợp nhất cho phôi trục cảm ứng phôi soma là môi trường 2,4D (20 mg/l) đối với cả 2 giống L23 và L26.
(2) Môi trường thích hợp nhất cho tái sinh phôi soma (trong phạm vi bố trí thí nghiệm của đề tài) là môi trường BAP (0,3 mg/l) đối với cả 2 giống L23 và L26. (3) Môi trường thích hợp cho ra rễ tạo cây hoàn chỉnh từ phôi soma là môi trường có bổ sung 0,3 mg/l NAA, tại môi trường này tỷ lệ tạo rễ, số rễ/cây và kích thước rễ là cao nhất.
(4) Tổng thời gian dành cho quy trình tái sinh cây hoàn chỉnh từ mô sẹo phôi mầm ở cả hai giống lạc tính từ khi tạo mô sẹo đến khi cây hoàn thiện bộ rễ là 26 tuần.
3.5. RA CÂY VÀ CHẾ ĐỘ CHĂM SÓC
Khi cây con trong ống nghiệm có kích thước 4 - 7 cm với hệ rễ phát triển được đưa ra ngoài nuôi trong cốc nhựa (Hình 3.14A), cây được chăm sóc cẩn thận (tiến hành như mục 2.2.1.5). Sau khoảng 20 – 28 ngày cây lạc mới mọc lá mới và rễ mới (Hình 3.14B). Tiếp đến chuyển cây ra vườn ươm đề cây tăng trưởng chiều cao, ra hoa và kết quả (Hình 3.14C, D).
Giá thể tốt nhất giúp cho cây lạc tái sinh trong ống nghiệm đạt tỷ lệ sống sót cao là hỗn hợp đất, cát với tỷ lệ là 1:1. Khi sử dụng loại giá thể này, tỷ lệ cây sống
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
59
sót là 80% cao hơn so với khi dùng các loại giá thể đơn lẻ chỉ có 100% đất hoặc 100% cát (tỷ lệ sống sót lần lượt là 30% và 42%), thời gian tạo lá mới và rễ mới cũng ngắn hơn (22 ngày so với 28, 30 ngày khi trồng trên giá thể 100% đất hoặc 100% cát)
Khi chuyển cây từ cốc nhựa sang vườn ươm, phần lớn các cây lạc tái sinh