Các phương pháp chuyển gen có thể được sử dụng cho việc chuyển đổi di truyền ở cây lạc đó là chuyển gen thông qua trung gian A. Tumefaciens hoặc thông qua các phương pháp chuyển giao DNA trực tiếp như xung điện hoặc bắn gen bằng vi đạn..., từ đó những gen mới có thể được đưa vào các tế bào mô lạc và biểu hiện tích cực. Trong lịch sử, cả hai phương pháp bắn gen bằng vi đạn và chuyển gen thông qua A. Tumefaciens đã được sử dụng để chuyển DNA, chúng cùng được tiến hành trong cả hai hệ thống tái sinh là phát sinh cơ quan và hình thành phôi vô tính ở lạc. Tuy nhiên phương pháp chuyển gen qua trung gian
Agrobacterium được áp dụng rộng rãi hơn ở cây lạc bởi mô lạc dễ bị nhiễm các chủng A. Tumefaciens [54], thời gian tái sinh cây chuyển gen ngắn hơn, kết quả các locus gen chuyển từ việc nhiễm khuẩn A.Tumefaciens ít phức tạp hơn (không tích hợp một lúc nhiều bản sao gen chuyển) so với việc được tạo ra bằng các phương pháp chuyển gen trực tiếp, do đó làm giảm nguy cơ tái sắp xếp gen chuyển và bất hoạt gen [63].
Sự chuyển gen thành công qua trung gian Agrobactenum chịu ảnh hưởng rất nhiều bởi các các yếu tố như: kiểu gen của giống, mẫu mô nuôi cấy, chủng A. Tumefaciens sử dụng, các plasmid mà vi khuẩn mang, điều kiện về thời gian đồng nuôi cấy và hiệu quả của hệ thống tái sinh. Đã có báo cáo sơ bộ về nghiên cứu tối ưu hóa của đồng nuôi cấy, so sánh các chủng Agrobacterium và các giống đậu phộng [42] và mô tả tiềm năng của các hệ thống tái sinh khác nhau để thích ứng với chuyển đổi qua trung gian Agrobacterium [73].
Trước những năm 2000 đã có nhiều báo cáo của nuôi cấy mô và tái sinh cây lạc từ các loại mẫu mô nuôi cấy khác nhau với sự kết hợp khác nhau của các chất điều hòa sinh trưởng trong các môi trường nuôi cấy, tuy nhiên đã không đạt được
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
20
nhiều thành công với chuyển đổi di truyền ở lạc do thiếu các phương thức hiệu quả để có được cây hoàn chỉnh thông qua việc tái sinh chồi trong ống nghiệm [75] (bảng 1.5). Điều này đã khiến một số nhà nghiên cứu tiếp cận phương pháp nuôi cấy mô không phụ thuộc vào sự tái sinh chồi ngẫu nhiên để tạo ra cây lạc biến đổi gen. Tác giả Rohini (2000) đã sử dụng phôi trục thiếu một lá mầm, sau khi gây tổn thương và cho nhiễm với Agrobacterium, đồng thời xử lý với dịch chiết từ lá bị thương của cây thuốc lá đã cho một tần số chuyển đổi di truyền ổn định 3,3% [70].
Bảng 1.5. Một số báo cáo chuyển gen ở cây lạc thông qua vi khuẩn A. tumefaciens
(trước năm 2000).
Mô cấy Gen
Chuyển
Hiệu quả chuyển gen
Báo cáo
Seedling Tumor - Lacorte et al. 1991
Leaf gus, nptII 6.7% Eapen and George 1994b
Embryonic axis uidA, nptII
9% McKently et al., 1995
Leaf gus, nptII 0.2-0.3% Cheng et al., 1997
Leaf and Epicotyl uidA 12-36% (leaves) 15-42% (epicotyl)
Egnin et al. 1998
Mature embryo axis with one cotyledon
gus, nptII 3.30% Rohini and Rao 2000
Gần đây, nghiên cứu chuyển gen chủ yếu thực hiện trên các loại mẫu cấy là: lá mầm (tử diệp), nách lá mầm, mô lá non, phôi trục hạt lạc. Trong đó, lá mầm lạc là một trong những đối tượng được nghiên cứu ứng dụng chuyển gen tương đối phổ biến. Lá mầm lạc sau khi trải qua giai đoạn tiền nuôi cấy 2 ngày rồi đồng nuôi cấy với Agrobacterium chủng LBA 4404, chứa pBI121 mang các gen uidA và gen
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
21
nptII, sau đó chuyển lên môi trường cảm ứng phôi có chứa NAA, BAP, kanamycin, và cefotaxime. Tỷ lệ lá mầm cảm ứng phôi trực tiếp cao và hiệu quả phôi chuyển đổi thành cây con đã tăng lên (47%) trên môi trường MS có BAP và kanamycin [87]. Hệ thống tái sinh dựa trên nuôi cấy lá mầm cũng đã được phát triển bởi Sharma và Anjaiah (2000) và nó cũng cho hiệu quả cao với tần số chuyển đổi trên 55% [75]. Tuy nhiên, tái sinh chồi từ mắt lá mầm sau khi tạo ra các vi vết thương và đồng nuôi cấy với vi khuẩn Agrobacterium cũng đang được xem như một phương pháp nhanh chóng và tương đối hiệu quả trong chuyển đổi di truyền ở một số các loài thuộc cây họ đậu [59]. Sau khi sử dụng nách lá mầm giống lạc JL- 24 đồng nuôi cấy 3 ngày với A. tumefaciens chủng GV2260 mang gen chỉ thị Gus và nptII tác giả Swathi Anuradha cùng cộng sự cũng đã tạo được cây lạc chuyển gen hoàn chỉnh với tần số chuyển đổi di truyền là 3,54% [79]. Các báo cáo cũng cho thấy, mỗi quy trình chuyển gen sẽ cho kết quả cụ thể với mỗi giống khác nhau trên các loại mô cấy khác nhau.
Những phát triển trong chuyển đổi di truyền ở cây lạc đã khích lệ các nhà nghiên cứu theo đuổi ý tưởng phát triển cây lạc biến đổi gen mang các gen hữu ích có khả năng sản xuất hạt với năng suất, chất lượng cao, có sức đề kháng cao với các bệnh khác nhau, kháng côn trùng gây hại, và áp lực phi sinh học. Chẳng hạn như việc chuyển gen tổng hợp protein vỏ của virus thông qua trung gian
Agrobacterium đã tạo ra các cây lạc có khả năng kháng virus [76]. Đây là phương pháp phát triển giống lạc thương mại quan trọng có sức đề kháng cao với vi rút gây bệnh đốm lá ở lạc. Hay thông qua trung gian Agrobacterium để tạo ra các cây lạc biến đổi gen biểu hiện protein hemagglutinin (H) – một loại protein ngưng kết tố hồng cầu của virus gây bệnh dịch hạch ở trâu bò từ đó sử dụng cho việc cung cấp vaccine thông qua thức ăn - một phương pháp tiêm phòng cho động vật nhai lại đã được thuần hóa cũng như động vật hoang dã [53]. Tác giả Chu (2007) bằng phương pháp bắn gen đã tạo ra cây lạc biến đổi gen biểu hiện gen Bcl-XL và thấy rằng một trong các dòng biến đổi gen được tăng cường khả năng chịu chất diệt cỏ,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
22
thuốc diệt cỏ [38]. Dodo (2008) bằng phương pháp sử dụng trung gian A.
Tumefaciens chủng EHA 105 đã phát triển lạc chuyển gen làm giảm dị ứng đậu phộng bằng cách sử dụng phương pháp can thiệp RNAi điều chỉnh gen Ara h2, điều này đã dẫn đến làm giảm biểu hiện gen Ara h2 và giảm việc gây dị ứng của hạt lạc [39]. Tương tự như vậy, Bhatnagar Mathur (2007) đã phát triển các cây lạc biến đổi gen bằng cách thể hiện gen At DREB1A bằng promoter rd29A và đã chứng minh rằng một trong những cây biến đổi gen đã cho thấy hiệu quả kiểm soát thoát hơi cao hơn 40% so với các cây trong cùng điều kiện hạn chế nước [29]. Tác giả Beena (2008) đã phát triển đậu phộng biến đổi gen biểu hiện cùng lúc hai gen, cryI E-C và a rice chitinase cDNA theo promotors CaMV35S bằng cách sử dụng hệ thống mắt lá mầm để chuyển gen. Các cây biến đổi gen cho thấy khả năng chống côn trùng spodoptera và đề kháng với nấm phaeoisariopsis personata, chúng là hai đối tượng gây bệnh nghiêm trọng trong canh tác đậu phộng [26] (bảng 1.6).
Bảng 1.6. Một số báo cáo chuyển gen ở cây lạc (từ năm 2000 - 2009)
Mô cấy Phƣơng thức Chuyển gen
Gen Chuyển
Báo cáo
Lá mầm A. tumefaciens uidA, nptII Venkatachalam et al., 2000
IPCV (coat protein) Sharma and Anjaiha 2000
H protein gene Khandelwal et al.,b2003
Lá chét non A. tumefaciens Sarker and Nahar 2003
Trục trên lá mầm
A. tumefaciens chủng LB4404
Quisheng et al. 2005
Mô sẹo phôi Particle bombardment
Joshi et al. 2005
Nách lá mầm A. tumefaciens
chủng GV2260
GUS, nptII Swathi Anuradha, 2006
Trục dưới lá mầm
A. tumefaciens
chủng EHA105
Arah 2 RNAi, nptII Dodo, H.W. Konan, 2007
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
23
chủng EHA105 nptII Divya, 2008
Lá mầm A. tumefaciens Tiwari et al. 2008
Mô sẹo phôi hoá
Particle bombardment
Chu et al. 2008
Nách lá mầm A. tumefaciens cryI E-C, a rice chitinase cDNA
Beena et al.2008
Lá mầm A. tumefaciens
chủng C58
AtDREB1A, nptII Bhatnagar-Mathur, 2007,2009
Chƣơng 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU, HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ 2.1.1. Nguyên liệu
Hạt của các giống lạc: L23, L26 được cung cấp bởi Trung tâm nghiên cứu và phát triển đậu đỗ, Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm –Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam.
2.1.2. Hóa chất và thiết bị 2.1.2.1. Hóa chất 2.1.2.1. Hóa chất
- Trong khử trùng mẫu: cồn 70 độ, giaven 60-70 %, dung dịch thủy ngân clorua (0,1-0,2%), nước cất vô trùng.
- Trong nuôi cấy mô và chuyển gen: Agarose, đường sucrose, dung dịch muối MS cơ bản (Murashige and Skoog 1962), Các chất kích thích sinh trưởng BAP, (2,4-D), NAA, IBA, IAA,...có nguồn gốc từ Trung Quốc, Ấn độ, Anh, Đức, Việt Nam.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
24
Cân phân tích điện tử (Thụy Sĩ), máy đo pH, nồi hấp khử trùng, tủ sấy Cabrolite (Anh), box cấy,... Các thiết bị máy móc tại Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào, khoa Sinh-KTNN - Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
Thí nghiệm được thực hiện từ tháng 3 năm 2010 đến tháng 12 năm 2012 tại Phòng thí nghiệm công nghệ tế bào thực vật thuộc khoa Sinh - Kỹ thuật nông nghiệp, trường Đại học sư phạm - Đại học Thái Nguyên.
Các bước nghiên cứu được tiến hành theo sơ đồ tổng quát được trình bày ở hình 2.1.
Hạt lạc Khử trùng
Tạo đa chồi từ mắt lá mầm
Thăm dò môi trường nuôi cấy in vitro
Tạo mô sẹo Hình thành phôi soma
Tái sinh cây
Ra rễ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
25
Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát
2.2.1. Phƣơng pháp nuôi cấy in vitro 2.2.1.1. Khử trùng hạt
Mẫu nuôi cấy là hạt lạc trưởng thành của giống lạc L23, L26 vừa mới được thu hoạch sau một thời gian ngắn được chuẩn bị theo các phương pháp khử trùng khác nhau:
- Phương pháp 1: Sau khi bóc lớp vỏ cứng của quả lạc đã được phơi khô, chọn những hạt to, mẩy, hạt lạc phải còn nguyên lớp vỏ lụa không bị nứt. Sử dụng khoảng 100-150 hạt lạc được chọn tráng qua nước cất vô trùng hai lần sau đó khử trùng bề mặt bằng cách lắc nhẹ trong cồn 70 độ trong thời gian 2 phút, sau đó tráng sạch bằng nước cất khử trùng 3 lần. Tiếp đến lắc với Javen trong 20 phút rồi rửa lại bằng nước cất khử trùng 4 đến 5 lần. Thí nghiệm với nồng độ Javen khác nhau để tìm kết quả tốt nhất.
- Phương pháp 2: Hạt lạc sau khi lắc nhẹ với cồn 70 độ và rửa bằng nước cất như trên thì được lắc với dung dịch thủy ngân clorua trong 7 phút rồi rửa lại bằng nước cất khử trùng 5 lần. Thí nghiệm với nồng độ thủy ngân clorua khác nhau để tìm kết quả khử trùng tốt nhất.
Khảo sát tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ hạt nảy mầm, độ đồng đều của mầm để chọn ra phương thức khử trùng tối ưu cho hạt giống nảy mầm in vitro.
2.2.1.2. Phƣơng pháp tái sinh cây từ hệ thống nuôi cấy nách lá mầm lạc (thực hiện theo tác giả Swathi Anuradha và cs (2006) [79], có cải tiến)
Tạo sự nảy mầm cho hạt
Hạt sau khi khử trùng được ngâm trong nước cất khử trùng 2-4 giờ, sau đó được thấm khô bằng giấy thấm khử trùng và cấy vào bình tam giác chứa môi trường nảy mầm GM(bảng 2.1). Sau khi ủ trên môi trường nảy mầm GM 3 ngày trong tối, được đưa ra sáng 3-4 ngày ở nhiệt độ 25 2°C. Ngày tuổi của hạt nảy
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
26
mầm được tính kể từ khi gieo hạt. Khảo sát khả năng nảy mầm hạt sau 3 ngày và 7 ngày, theo dõi tỷ lệ nảy mầm của hai giống.
Xử lý mẫu cấy và môi trƣờng tạo đa chồi
Hạt lạc sau khi gieo nảy mầm (7-8 ngày tuổi) thì tiến hành dùng dao cắt bỏ phần thân và rễ mầm, vết cắt cách bên dưới mắt lá mầm khoảng 2 mm. Tách đôi 2 lá mầm thành 2 mẫu cấy riêng biệt sao cho phần thân mầm còn lại được chia đều cho 2 lá mầm. Cắt ngang bỏ phần đuôi lá mầm, tiếp đến hủy bỏ chồi chính và gây thương tổn ở nách lá mầm bằng cách dùng mũi dao nhọn chích nhẹ 5-7 lần vào vùng nách lá mầm. Như vậy, từ một hạt giống nảy mầm cho ra 2 mẫu cấy. Sau đó các mẫu cấy được cấy úp nghiêng 45 độ trên môi trường cảm ứng chồi SIM (bảng 2.1), nuôi cấy trong 8 tuần.
Đánh giá tỷ lệ cảm ứng tạo đa chồi và số chồi / 1 mẫu cấy của 2 giống lạc sau 8 tuần nuôi cấy theo công thức:
% 100 (%) t cp i N N C Trong đó:
Ci : Tỷ lệ tạo đa chồi
Ncp: Số mẫu cảm ứng đa chồi Nt : Tổng số mẫu nuôi cấy
Môi trƣờng kéo dài chồi
Các cụm chồi được tách riêng và cấy chuyển sang môi trường kéo dài chồi (SEM) trong 2 tuần (Bảng 2.1).
Môi trƣờng ra rễ
Khi chồi đạt chiều cao 3-5 cm và có hai hoặc ba lóng, chúng được chuyển sang môi trường ra rễ RIM (Bảng 2.1) để tạo cây hoàn chỉnh. Mỗi bình cấy từ 3-4 chồi. Đánh giá khả năng hình thành và phát triển rễ của cây tái sinh sau 4 tuần.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
27
Các khâu nuôi cấy từ khi tạo cảm ứng đa chồi đến khi ra rễ được tiến hành ở nhiệt độ dao động trong khoảng 25 2°C, dưới ánh sáng đèn của phòng cây với cường độ 2000 lux, thời gian chiếu sáng 10/24 giờ.
Bảng 2.1: Thành phần các loại môi trường nuôi cấy dùng cho hệ thống tái sinh cây từ nách lá mầm
Loại môi trường hiệu Ký Thành phần cơ bản Cảm ứng nảy mầm
của hạt GM MS*; sucrose 20g/l; agar 9g/l; pH 5,8 Cảm ứng tạo đa chồi SIM
MS*; BAP (3,4,5mg/l) hoặc BAP (3,4,5 mg/l) + NAA (0,1 ; 0,5mg/l); sucrose 30g/l; agar 9g/l; vitamin B5, pH 5,8
Cảm ứng kéo dài
chồi SEM
MS*; BAP (1,5mg/l, 2mg/l, 2,5mg/l) hoặc BAP (1,5; 2; 2,5 mg/l) + NAA (0,1 ; 0,5mg/l); sucrose 30g/l; agar 9g/l; vitamin B5, pH 5,8 Cảm ứng ra rễ RIM MS*; NAA (0,1; 0,3; 0.5mg/l) hoặc IBA (0,1;
0,3; 0.5mg/l); sucrose 30g/l; agar 9g/l; pH 5,8
Chú thích: MS*: Môi trường cơ bản của Murashige và Skoog (1962) [57].
2.2.1.3. Phƣơng pháp tái sinh cây từ hệ thống nuôi cấy mô sẹo phôi trục hạt lạc (thực hiện theo tác giả Nguyễn Thị Tâm và cs (2006) [13], có cải tiến)
Tạo mô sẹo từ phôi trục hạt lạc
Hạt lạc sau khi khử trùng được đặt lên đĩa có lót giấy thấm khử trùng, dùng panh và dao mỏng tách bỏ lớp vỏ và phần nội nhũ, để tách lấy phôi trục khỏi hai lá mầm. Các phôi trục phải đảm bảo vẫn còn nguyên vẹn, không để phôi bị khô, loại bỏ bất kỳ phôi bị nứt vỡ, hư hỏng hoặc đen, nâu. Phôi trục của các giống lạc L23, L26 sau khi tách ra được đặt lên môi trường cảm ứng mô sẹo gồm: MS cơ bản; 2,4D (8, 10, 12, 14mg/L); sucrose 30g/l; agarose 9g/l; pH 5,8. Cấy mật độ 15 phôi/1 bình môi trường loại 250 ml. Nuôi 1 tuần trong tối hoàn toàn và 3 ngày dưới ánh sáng đèn neol trong phòng nuôi cấy với cường độ 2000 lux, thời gian chiếu sáng 10/24 giờ, nhiệt độ dao động trong khoảng 25 2°C. Đánh giá tỷ lệ tạo mô sẹo của 2 giống lạc thu được sau 10 ngày nuôi cấy theo công thức:
% 100 (%) t cp i N N C
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
28 Trong đó:
Ncp: Số phôi tạo mô sẹo Nt : Tổng số phôi nuôi cấy Ci : Tỷ lệ tạo mô sẹo
Tính tốc độ sinh trưởng của mô sẹo bằng cách cân khối lượng các mô sẹo được tạo thành sau 10 ngày.
Tái sinh chồi từ mô sẹo phôi trục hạt lạc