2.1.2.1. Hóa chất
- Trong khử trùng mẫu: cồn 70 độ, giaven 60-70 %, dung dịch thủy ngân clorua (0,1-0,2%), nước cất vô trùng.
- Trong nuôi cấy mô và chuyển gen: Agarose, đường sucrose, dung dịch muối MS cơ bản (Murashige and Skoog 1962), Các chất kích thích sinh trưởng BAP, (2,4-D), NAA, IBA, IAA,...có nguồn gốc từ Trung Quốc, Ấn độ, Anh, Đức, Việt Nam.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
24
Cân phân tích điện tử (Thụy Sĩ), máy đo pH, nồi hấp khử trùng, tủ sấy Cabrolite (Anh), box cấy,... Các thiết bị máy móc tại Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào, khoa Sinh-KTNN - Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
Thí nghiệm được thực hiện từ tháng 3 năm 2010 đến tháng 12 năm 2012 tại Phòng thí nghiệm công nghệ tế bào thực vật thuộc khoa Sinh - Kỹ thuật nông nghiệp, trường Đại học sư phạm - Đại học Thái Nguyên.
Các bước nghiên cứu được tiến hành theo sơ đồ tổng quát được trình bày ở hình 2.1.
Hạt lạc Khử trùng
Tạo đa chồi từ mắt lá mầm
Thăm dò môi trường nuôi cấy in vitro
Tạo mô sẹo Hình thành phôi soma
Tái sinh cây
Ra rễ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
25
Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát
2.2.1. Phƣơng pháp nuôi cấy in vitro 2.2.1.1. Khử trùng hạt
Mẫu nuôi cấy là hạt lạc trưởng thành của giống lạc L23, L26 vừa mới được thu hoạch sau một thời gian ngắn được chuẩn bị theo các phương pháp khử trùng khác nhau:
- Phương pháp 1: Sau khi bóc lớp vỏ cứng của quả lạc đã được phơi khô, chọn những hạt to, mẩy, hạt lạc phải còn nguyên lớp vỏ lụa không bị nứt. Sử dụng khoảng 100-150 hạt lạc được chọn tráng qua nước cất vô trùng hai lần sau đó khử trùng bề mặt bằng cách lắc nhẹ trong cồn 70 độ trong thời gian 2 phút, sau đó tráng sạch bằng nước cất khử trùng 3 lần. Tiếp đến lắc với Javen trong 20 phút rồi rửa lại bằng nước cất khử trùng 4 đến 5 lần. Thí nghiệm với nồng độ Javen khác nhau để tìm kết quả tốt nhất.
- Phương pháp 2: Hạt lạc sau khi lắc nhẹ với cồn 70 độ và rửa bằng nước cất như trên thì được lắc với dung dịch thủy ngân clorua trong 7 phút rồi rửa lại bằng nước cất khử trùng 5 lần. Thí nghiệm với nồng độ thủy ngân clorua khác nhau để tìm kết quả khử trùng tốt nhất.
Khảo sát tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ hạt nảy mầm, độ đồng đều của mầm để chọn ra phương thức khử trùng tối ưu cho hạt giống nảy mầm in vitro.
2.2.1.2. Phƣơng pháp tái sinh cây từ hệ thống nuôi cấy nách lá mầm lạc (thực hiện theo tác giả Swathi Anuradha và cs (2006) [79], có cải tiến)
Tạo sự nảy mầm cho hạt
Hạt sau khi khử trùng được ngâm trong nước cất khử trùng 2-4 giờ, sau đó được thấm khô bằng giấy thấm khử trùng và cấy vào bình tam giác chứa môi trường nảy mầm GM(bảng 2.1). Sau khi ủ trên môi trường nảy mầm GM 3 ngày trong tối, được đưa ra sáng 3-4 ngày ở nhiệt độ 25 2°C. Ngày tuổi của hạt nảy
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
26
mầm được tính kể từ khi gieo hạt. Khảo sát khả năng nảy mầm hạt sau 3 ngày và 7 ngày, theo dõi tỷ lệ nảy mầm của hai giống.
Xử lý mẫu cấy và môi trƣờng tạo đa chồi
Hạt lạc sau khi gieo nảy mầm (7-8 ngày tuổi) thì tiến hành dùng dao cắt bỏ phần thân và rễ mầm, vết cắt cách bên dưới mắt lá mầm khoảng 2 mm. Tách đôi 2 lá mầm thành 2 mẫu cấy riêng biệt sao cho phần thân mầm còn lại được chia đều cho 2 lá mầm. Cắt ngang bỏ phần đuôi lá mầm, tiếp đến hủy bỏ chồi chính và gây thương tổn ở nách lá mầm bằng cách dùng mũi dao nhọn chích nhẹ 5-7 lần vào vùng nách lá mầm. Như vậy, từ một hạt giống nảy mầm cho ra 2 mẫu cấy. Sau đó các mẫu cấy được cấy úp nghiêng 45 độ trên môi trường cảm ứng chồi SIM (bảng 2.1), nuôi cấy trong 8 tuần.
Đánh giá tỷ lệ cảm ứng tạo đa chồi và số chồi / 1 mẫu cấy của 2 giống lạc sau 8 tuần nuôi cấy theo công thức:
% 100 (%) t cp i N N C Trong đó:
Ci : Tỷ lệ tạo đa chồi
Ncp: Số mẫu cảm ứng đa chồi Nt : Tổng số mẫu nuôi cấy
Môi trƣờng kéo dài chồi
Các cụm chồi được tách riêng và cấy chuyển sang môi trường kéo dài chồi (SEM) trong 2 tuần (Bảng 2.1).
Môi trƣờng ra rễ
Khi chồi đạt chiều cao 3-5 cm và có hai hoặc ba lóng, chúng được chuyển sang môi trường ra rễ RIM (Bảng 2.1) để tạo cây hoàn chỉnh. Mỗi bình cấy từ 3-4 chồi. Đánh giá khả năng hình thành và phát triển rễ của cây tái sinh sau 4 tuần.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
27
Các khâu nuôi cấy từ khi tạo cảm ứng đa chồi đến khi ra rễ được tiến hành ở nhiệt độ dao động trong khoảng 25 2°C, dưới ánh sáng đèn của phòng cây với cường độ 2000 lux, thời gian chiếu sáng 10/24 giờ.
Bảng 2.1: Thành phần các loại môi trường nuôi cấy dùng cho hệ thống tái sinh cây từ nách lá mầm
Loại môi trường hiệu Ký Thành phần cơ bản Cảm ứng nảy mầm
của hạt GM MS*; sucrose 20g/l; agar 9g/l; pH 5,8 Cảm ứng tạo đa chồi SIM
MS*; BAP (3,4,5mg/l) hoặc BAP (3,4,5 mg/l) + NAA (0,1 ; 0,5mg/l); sucrose 30g/l; agar 9g/l; vitamin B5, pH 5,8
Cảm ứng kéo dài
chồi SEM
MS*; BAP (1,5mg/l, 2mg/l, 2,5mg/l) hoặc BAP (1,5; 2; 2,5 mg/l) + NAA (0,1 ; 0,5mg/l); sucrose 30g/l; agar 9g/l; vitamin B5, pH 5,8 Cảm ứng ra rễ RIM MS*; NAA (0,1; 0,3; 0.5mg/l) hoặc IBA (0,1;
0,3; 0.5mg/l); sucrose 30g/l; agar 9g/l; pH 5,8
Chú thích: MS*: Môi trường cơ bản của Murashige và Skoog (1962) [57].
2.2.1.3. Phƣơng pháp tái sinh cây từ hệ thống nuôi cấy mô sẹo phôi trục hạt lạc (thực hiện theo tác giả Nguyễn Thị Tâm và cs (2006) [13], có cải tiến)
Tạo mô sẹo từ phôi trục hạt lạc
Hạt lạc sau khi khử trùng được đặt lên đĩa có lót giấy thấm khử trùng, dùng panh và dao mỏng tách bỏ lớp vỏ và phần nội nhũ, để tách lấy phôi trục khỏi hai lá mầm. Các phôi trục phải đảm bảo vẫn còn nguyên vẹn, không để phôi bị khô, loại bỏ bất kỳ phôi bị nứt vỡ, hư hỏng hoặc đen, nâu. Phôi trục của các giống lạc L23, L26 sau khi tách ra được đặt lên môi trường cảm ứng mô sẹo gồm: MS cơ bản; 2,4D (8, 10, 12, 14mg/L); sucrose 30g/l; agarose 9g/l; pH 5,8. Cấy mật độ 15 phôi/1 bình môi trường loại 250 ml. Nuôi 1 tuần trong tối hoàn toàn và 3 ngày dưới ánh sáng đèn neol trong phòng nuôi cấy với cường độ 2000 lux, thời gian chiếu sáng 10/24 giờ, nhiệt độ dao động trong khoảng 25 2°C. Đánh giá tỷ lệ tạo mô sẹo của 2 giống lạc thu được sau 10 ngày nuôi cấy theo công thức:
% 100 (%) t cp i N N C
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
28 Trong đó:
Ncp: Số phôi tạo mô sẹo Nt : Tổng số phôi nuôi cấy Ci : Tỷ lệ tạo mô sẹo
Tính tốc độ sinh trưởng của mô sẹo bằng cách cân khối lượng các mô sẹo được tạo thành sau 10 ngày.
Tái sinh chồi từ mô sẹo phôi trục hạt lạc
Mô sẹo tốt nhất tạo ra từ phôi trục trên môi trường cảm ứng được cấy chuyển sang môi trường tái sinh chồi gồm MS cơ bản; BAP (1,5mg/l; 2,0mg/l; 2,5mg/l; 3mg/l); sucrose 30g/l; agarose 9g/l; pH 5,8. Các mô sẹo được tái sinh ở các trạng thái khác nhau là : mô sẹo để nguyên khối, mô sẹo chẻ đôi, mô sẹo chẻ làm tư theo chiều dọc mô sẹo. Nuôi cấy trong 4 tuần dưới ánh sáng đèn của phòng cây với cường độ 2000 lux, thời gian chiếu sáng 10/24 giờ, nhiệt độ dao động trong khoảng 25 2°C.
Tỷ lệ mô tái sinh cây được tính theo công thức:
% 100 (%) sv r c N N R Trong đó:
Rc: Khả năng tái sinh cây Nr: Số mô sẹo tái sinh cây Nsv: Tổng số mô sẹo
Tạo cây hoàn chỉnh
Các chồi sau tái sinh đạt kích thước khoảng 2,0 – 2,5cm được chuyển sang môi trường ra rễ để tạo cây hoàn chỉnh. Môi trường ra rễ là môi trường MS cơ bản; thạch agar 9g/l; đường sucrose 30g/l; NAA (0,3 mg/l); pH 5,8. Mỗi bình cấy trung bình từ 3-4 chồi. Nuôi cấy dưới ánh sáng đèn của phòng cây với cường độ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
29
2000 lux, thời gian chiếu sáng 10/24 giờ, nhiệt độ dao động trong khoảng 25
2°C. Đánh giá khả năng hình thành và phát triển rễ của cây tái sinh sau 4 tuần.
2.2.1.4. Phƣơng pháp tái sinh cây từ hệ thống nuôi cấy hình thành phôi soma
(áp dụng theo phương pháp của Shweta Singh (2009) [77], có cải tiến)
Phôi trục của các giống lạc L23, L26 sau khi tách khỏi hạt vừa được khử trùng (mục 2.2.1.1) đem ngâm riêng trong nước cất 2 lần trong khoảng 12 - 16 giờ (nước cất được hấp khử trùng). Sau khi ngâm, chắt bỏ nước trong ống đựng phôi, khử trùng phôi trục lạc một lần nữa bằng thủy ngân clorua 0,1% trong 3 phút và lại rửa 4-5 lần bằng nước cất khử trùng. Rải phôi lên đĩa có lót giấy thấm khử trùng cho khô rồi đặt phôi trục đã no nước lên môi trường nuôi cấy trải qua các giai đoạn nuôi cấy như sau:
- Giai đoạn I (Tiền cảm ứng phôi soma): Phôi trục được cấy trên môi trường tiền cảm ứng phôi soma PM (Bảng 2.2), cấy trung bình 10 phôi/bình tam giác 250 ml, ủ một tuần trong tối và trong 5 tuần ngoài ánh sáng phòng cây.
- Giai đoạn II (Phát triển cụm phôi soma): Chọn những phôi trục cảm ứng ở giai đoạn I (phôi trục cảm ứng không nhớt, không đen, nâu) cấy chuyển sang môi trường phát triển phôi EM (Bảng 2.2) để thúc đẩy sự phát triển cụm phôi và hoàn thiện phôi soma. Nuôi cấy trong 4 tuần.
- Giai đoạn III (Nảy mầm phôi soma): Cụm phôi soma thu được ở giai đoạn II được tách thành các phôi đơn lẻ để cấy chuyển sang môi trường nảy mầm phôi SM (Bảng 2.2). Duy trì nuôi cấy trong 12 tuần để tạo cây hoàn chỉnh, cứ sau 4 tuần cấy chuyển sang môi trường nuôi cấy mới một lần.
- Giai đoạn IV (Hoàn thiện cây): Cây non được kích thích phát triển bộ rễ trên môi trường ra rễ RM (Bảng 2.2) trong 4 tuần.
Bảng 2.2: Thành phần các loại môi trường nuôi cấy dùng cho hệ thống tái sinh cây từ phôi soma
Loại môi trường Ký hiệu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 30 Tiền cảm ứng phôi soma từ phôi trục PM MS*; sucrose 60g/l; 2,4-D (10, 20, 30 mg/l); vitamin B5**, agar 9g/l; pH 5,8 Phát triển cụm phôi soma EM MS*; sucrose 60g/l; 2,4-D 3mg/l; vitamin B5**, agar 9g/l; pH 5,8
Phôi soma nảy mầm SM MS*; sucrose 30g/l; BAP (0; 0,1; 0.3; 0,5mg/l); NAA (0,05mg/l); vitamin B5**, agar 9g/l; pH 5,8
Tạo rễ RM MS*; sucrose 30g/l; NAA (0, 0,3mg/l); vitamin B5**, agar 9g/l; pH 5,8
Chú thích: - MS*: Môi trường cơ bản của Murashige and skoog (1962) [57].
- Vitamin B5**: Môi trường được bổ sung vitamin B5 theo Gamborg (1968) [45].
Các giai đoạn nuôi cấy in vitro được thực hiện trong phòng nuôi cấy trong điều kiện dưới ánh sáng đèn neon với cường độ 2000 lux, thời gian chiếu sáng 10/24 giờ, nhiệt độ phòng nuôi dao động trong khoảng 25 2°C. Đánh giá tỷ lệ cảm ứng cụm đa phôi soma, số phôi trung bình/cụm, tỷ lệ tái sinh cây từ phôi soma của 2 giống lạc.
2.2.1.5. Ra cây và chế độ chăm sóc
Các bình nuôi cấy chứa cây tái sinh hoàn chỉnh chuyển ra khỏi phòng nuôi cây để trong phòng có ánh sáng và nhiệt độ bình thường 2-3 ngày rồi mới được mở nút, cho nước vào ngâm, sau đó lắc nhẹ cho thạch rời khỏi rễ cây. Dùng panh cặp nhẹ cây kéo ra khỏi bình tam giác (chú ý tránh dập nát), rửa cẩn thận cho hết lớp agar bám quanh gốc bằng nước sạch sau đó trồng trên nền giá thể tơi xốp (giá thể trồng cây: đất, cát hoặc đất trộn cát tỷ lệ 1 đất : 1 cát) rồi dùng dung dịch MS cơ bản pha loãng 10 lần phun tưới nhẹ vào gốc. Sử dụng mái che chắn cho cây khỏi bị ánh sáng mạnh chiếu trực tiếp vào cây. Sau khi cây sống ra rễ mới, lá mới có thể đưa ra ngoài vườn ươm.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
31
Tất cả các thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần và sử dụng bộ công cụ Data Analysis Toolpact của phần mềm Excel 2003 để xác định các trị số thống kê như trung bình mẫu (mean), phương sai (variance), độ lệch chuẩn (standard deviation), sai số chuẩn trung bình mẫu (standard error) và khoảng tin cậy cho trung bình tổng thể (Confidence Lever (95%)), n ≥ 30, mức ý nghĩa α = 0,05. Tiến hành phân tích theo Chu Hoàng Mậu (2008) [19].
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. ẢNH HƢỞNG CỦA NỒNG ĐỘ CÁC CHẤT ĐẾN KẾT QUẢ KHỬ TRÙNG HẠT LẠC
Hạt lạc là đối tượng chứa rất nhiều dầu, là điều kiện lý tưởng cho các loại vi khuẩn, nấm mốc phát triển, vì vậy việc lựa chọn ra một phương pháp khử trùng tối ưu là rất cần thiết để chuẩn bị mẫu cho quá trình nuôi cấy in vitro tiếp theo.
Chúng tôi tiến hành thí nghiệm với 150 hạt lạc được xúc nhẹ nhàng trong cồn 70 độ trong thời gian 2 phút và Javen trong thời gian 20 phút với các nồng độ của Javen là: 60%, 65%, 70%. Kết quả nghiên cứu chúng tôi thấy Javen ở nồng độ 65% thích hợp nhất cho khử trùng hạt lạc, tỷ lệ bị nhiễm thấp (dao động từ 1,3% - 2,7%), khả năng hạt bị thối rất thấp lại vừa đảm bảo tỷ lệ nảy mầm và độ đồng đều
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
32
của mầm cao (96% – 98%). Trong thực tế hạt lạc là đối tượng rất khó khử trùng, nếu khử trùng bằng nước Javen với nồng độ quá cao và thời gian quá dài thì tỷ lệ hạt bị tổn thương, bị thối cao, hạt nảy mầm kém và độ đồng đều của mầm không cao. Ngược lại, nếu nồng độ Javen thấp thì không đủ khử nhiễm nên tỷ lệ nhiễm cao sau khi cấy.
Cũng tiến hành thí nghiệm khác với 150 hạt lạc được xúc nhẹ nhàng cồn 70 độ trong thời gian 2 phút nhưng sau đó hạt lạc được xúc trong dung dịch thủy ngân clorua trong thời gian 7 phút với các nồng độ của thủy ngân clorua là 0,1% và 0,2%. Chúng tôi thấy dung dịch thủy ngân clorua ở nồng độ 0,2% tỏ ra thích hợp nhất cho khử trùng hạt lạc với tỷ lệ mẫu nhiễm rất thấp (0,2%), tỷ lệ nảy mầm hạt là 100%, mầm khỏe, độ đồng đều của mầm cao.
So sánh hai phương pháp khử trùng hạt (bằng Javen và thủy ngân clorua), chúng tôi thấy phương pháp khử trùng bằng dung dịch thủy ngân clorua 0,2% tỏ ra ưu thế hơn, vì vậy chúng tôi lựa chọn phương pháp khử trùng hạt trong cồn 70 độ (trong 2 phút) và thủy ngân clorua 0,2% (trong 7 phút) để khử trùng hạt tạo nguyên liệu cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2. KẾT QUẢ TÁI SINH CÂY LẠC TỪ NÁCH LÁ MẦM 3.2.1. Môi trƣờng tạo sự nảy mầm cho hạt lạc 3.2.1. Môi trƣờng tạo sự nảy mầm cho hạt lạc
Hạt đã khử trùng (mục 3.1) được ngâm trong nước cất 2 - 4 tiếng sau đó cấy trên môi trường nảy mầm GM. Ở giai đoạn này hạt chủ yếu sử dụng chất dinh dưỡng có sẵn trong hạt nên môi trường chỉ cần cung cấp những chất cơ bản và không cần cung cấp nhóm kích thích sinh trưởng. Ở cả hai giống L23 và L26 hạt đều bắt đầu nứt vỏ nhú rễ mầm sau 3 ngày nuôi cấy và hạt nảy mầm hoàn chỉnh, có màu xanh rõ rệt sau 6 ngày (đối với giống L26), 7 ngày (đối với giống L23), tỷ lệ nảy mầm đạt 98% – 100% , thân mầm mập, chất lượng mầm đồng đều đối với