3.2.1. Môi trƣờng tạo sự nảy mầm cho hạt lạc
Hạt đã khử trùng (mục 3.1) được ngâm trong nước cất 2 - 4 tiếng sau đó cấy trên môi trường nảy mầm GM. Ở giai đoạn này hạt chủ yếu sử dụng chất dinh dưỡng có sẵn trong hạt nên môi trường chỉ cần cung cấp những chất cơ bản và không cần cung cấp nhóm kích thích sinh trưởng. Ở cả hai giống L23 và L26 hạt đều bắt đầu nứt vỏ nhú rễ mầm sau 3 ngày nuôi cấy và hạt nảy mầm hoàn chỉnh, có màu xanh rõ rệt sau 6 ngày (đối với giống L26), 7 ngày (đối với giống L23), tỷ lệ nảy mầm đạt 98% – 100% , thân mầm mập, chất lượng mầm đồng đều đối với cả hai giống lạc, đủ điều kiện để sử dụng cho các bước nuôi cấy tiếp theo (Hình 3.1). T Swathi Anuradha (2006) đã sử dụng hạt giống JL-24 nảy mầm 6 ngày tuổi để tạo nguyên liệu nuôi cấy cho các thí nghiệm của mình.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
33
Hạt lạc lúc mới cấy Hạt nảy mầm sau 7 ngày cấy
Hình 3.1. Hạt giống L26 nuôi cấy trên môi trường GM sau 7 ngày
3.2.2. Môi trƣờng cảm ứng chồi ở nách lá mầm
3.2.2.1. Ảnh hƣởng của nồng độ BAP và tổ hợp BAP với NAA đến khả năng cảm ứng tạo chồi của hai giống lạc nghiên cứu
Tái sinh chồi từ mắt lá mầm đang được xem như một phương pháp nhanh chóng và tương đối hiệu quả trong tái sinh và chuyển đổi di truyền ở một số các loài thuộc cây họ đậu [59], nó đã được nghiên cứu trên pea [28], đậu xanh [50], đậu tương [59], Vigna mungo [72] và lạc [79]. Giai đoạn cảm ứng tạo chồi là giai đoạn quan trọng trong quá trình phát triển chồi từ nách lá mầm. Môi trường cảm ứng tạo chồi ở đa số các loài thực vật cần sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin và xytokinin như IAA, IBA, BAP...Trong đó BAP thuộc nhóm kích thích sinh trưởng xytokinin được sử dụng phổ biến để tạo cảm ứng chồi ở nhiều loài thực vật khác nhau. Vì việc sử dụng nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thích hợp có ý nghĩa quan trọng đối với từng giai đoạn phát triển của cây. Đây là nguyên tắc cơ bản trong nuôi cấy mô tế bào [18].
Khả năng cảm ứng tạo chồi và số lượng chồi trung bình/ một mảnh lá mầm là những thông số dùng để đánh giá tính thích ứng của giống trong hệ thống nuôi cấy in vitro. Trong quá trình thí nghiệm chúng tôi đã sử dụng BAP và tổ hợp của BAP với NAA để tạo đa chồi ở cả hai giống lạc. Sau khi cấy trên môi trường cảm ứng tạo chồi, mẫu cấy trở nên xanh đậm màu hơn, diện tích bề mặt lá mầm và
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
34
nách lá mầm tăng lên, phần cuống lá mầm kéo dài rõ rệt sau 5 ngày nuôi cấy và phần lớn chúng uốn cong ngược với bề mặt môi trường nuôi cấy. Điều này xảy ra có thể do tác dụng của các chất điều hòa sinh trưởng đã kích thích đến sự phân chia và kéo dãn vách của các lớp tế bào bề mặt mẫu cấy phần tiếp xúc với môi trường nuôi cấy. Sau 2 tuần nuôi cấy thì các chồi chính (có thể từ 1 – 4 chồi) và các mầm chồi được hình thành trực tiếp từ khu vực nách lá mầm. Có rất nhiều mầm chồi nhỏ li ti, chúng nổi lên thành cụm trên mẫu cấy ngay tại vùng nách lá mầm mà không thấy xuất hiện mô sẹo (hình 3.2(A)). Sau 4 tuần nuôi cấy tiếp theo trên cùng môi trường SIM, chồi chính phát triển mạnh mẽ với thân và lá của chồi mập, xanh và khỏe, kích thước chồi chính đạt 3-4 cm. Lúc này chồi chính đã có thể được tách khỏi cụm chồi để chuyển qua môi trường ra rễ, còn các mầm chồi nhỏ li ti phát sinh trên bề mặt nách lá mầm (số lượng khác nhau tùy từng loại môi trường cụ thể) cũng đã bắt đầu nảy chồi và hình thành lá với diện tích bề mặt lá nhỏ (hình 3.2(B)). Tiếp tục nuôi cụm chồi này thêm 2 tuần nữa trên cùng một môi trường SIM thì các chồi được tăng trưởng kéo dài thêm đồng thời lá của chồi vươn ra và xòe rộng hơn (hình 3.2(C)).
A (Sau 2 tuần) B (Sau 6 tuần) C (Sau 8 tuần)
Hình 3.2. Hình ảnh giống L23 nuôi cấy trên môi trường cảm ứng chồi SIM
A - Nách lá mầm hình thành chồi và xuất hiện nhiều mầm chồi nhỏ li ti tập trung thành cụm (mũi tên)
B – Các mầm nảy chồi thành cụm chồi và hình thành lá nhỏ sau 6 tuần nuôi cấy
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
35
Kết quả nghiên cứu trên hai giống lạc L23 và L26 được phân tích và thể hiện ở bảng 3.1 cho thấy: Tần số tái sinh chồi và số chồi được hình thành trong các môi trường nuôi cấy chỉ có BAP là đều ở mức thấp đối với cả hai giống L23 và L26. Trong khi đó khả năng tạo cảm ứng chồi và số lượng chồi trung bình/ 1 mẫu cấy ở các tổ hợp BAP với NAA là cao hơn và có sự khác nhau ở 2 giống lạc L23 và L26. Còn lại, trên môi trường đối chứng không có chất điều hòa sinh trưởng, các mẫu cấy không có dấu hiệu cảm ứng tạo chồi. Điều đó cho thấy bản thân các mẫu cấy là nách lá mầm của hai giống lạc không có đủ các chất điều hòa sinh trưởng nội sinh cần thiết mà phải cần được cung cấp từ bên ngoài môi trường để cảm ứng tạo chồi. Việc bổ sung NAA làm tăng tần số tái sinh chồi, cũng cho thấy hiệu quả của sự phối hợp các chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin và xytokinin để cảm ứng tạo chồi là cao hơn khi chỉ sử dụng xytokinin một cách đơn lẻ.
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ BAP và tổ hợp BAP với NAA đến khả năng cảm ứng tạo chồi Giống lạc BAP NAA Số mảnh cấy Tỷ lệ tạo chồi sau 8 tuần (%) Số chồi chính /1 mảnh lá Số chồi mầm /1 mảnh lá Chất lƣợng chồi (mg/l) L23 0 0 30 0 0 0 3 0 100 41,3 1,14 3,57 ± 0,23 - 4 0 100 47,3 1,21 4,12 ± 0,39 - 5 0 100 44,7 1,44 5,04 ± 0,37 - 3 0,1 100 57,0 1,33 4,07 ± 0,28 - 4 0,1 100 75,0 1,53 6,29 ± 0,28 + 5 0,1 100 64,0 1,42 5,85 ± 0,26 + 3 0,5 100 57,7 1,22 5,01 ± 0,19 - 4 0,5 100 64,7 1,38 5,64 ± 0,20 + 5 0,5 100 65,7 1,35 5,56 ± 0,21 +
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 36 L26 0 0 30 0 0 0 3 0 100 34,0 1,06 3,64 ± 0,24 - 4 0 100 40,7 1,10 3,83 ± 0,22 - 5 0 100 44,7 1,07 3,84 ± 0,22 - 3 0,1 100 45,3 1,13 3,87 ± 0,19 - 4 0,1 100 58,7 1,12 4,14 ± 0,20 - 5 0,1 100 56,0 1,07 4,21 ± 0,23 + 3 0,5 100 47,3 1,04 4,21 ± 0,24 - 4 0,5 100 57,7 1,07 4,83 ± 0,21 + 5 0,5 100 69,0 1,43 5,68 ± 0,26 +
Ghi chú: Chất lượng chồi: (-) : Chồi yếu, có màu vàng hoặc trắng; (+): Chồi khỏe, có màu xanh
Việc tìm kiếm một sự kết hợp tối ưu theo tỷ lệ xác định của auxin và cytokinin là rất quan trọng và cần thiết cho sự cảm ứng tạo đa chồi, nó đã được tiến hành nghiên cứu không chỉ riêng ở đối tượng cây lạc mà còn ở nhiều loài thực vật khác. Trong số các mức nồng độ BAP phối hợp với NAA được thử nghiệm, giống lạc L23 phản ứng tốt nhất trên môi trường SIM có chứa 4,0mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA khi đạt tỷ lệ cảm ứng chồi là 75,0% và số chồi TB/1 mảnh lá mầm là 6,29; còn giống L26 phản ứng tốt nhất trên môi trường SIM có chứa 5,0 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA khi đạt tỷ lệ cảm ứng chồi là 69,0%, số chồi trung bình/ 1 mảnh lá mầm là 5,68. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của các tác giả Banerjee (1988); Swathi Anuradha (2006). Trong các báo cáo của mình, các tác giả trên đều kết luận rằng kết hợp của BAP với NAA tác động rất hiệu quả cho sự tạo cảm ứng đa chồi từ nách lá mầm lạc [25], [79].
Xem xét một cách tổng thể chúng tôi thấy cả hai giống lạc có khả năng cảm ứng tạo chồi là khác nhau (hình 3.3), cụ thể là tỷ lệ cảm ứng tạo chồi và số lượng chồi trung bình/ mẫu cấy (sau 8 tuần) trên các loại môi trường SIM của giống L23 là 57,5% và 5,02 chồi/ mẫu còn ở giống L26 thì thấp hơn là 50,4% và 4,24 chồi/
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
37
mẫu (bảng 3.1). Sự khác biệt này do đặc điểm di truyền đặc trưng của mỗi giống quyết định.
A B
Hình 3.3. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và NAA đến khả năng cảm ứng tạo chồi của các giống lạc sau 6 tuần nuôi cấy (A: Giống L23, B: Giống L26)
3.2.2.2. Ảnh hƣởng của tác động gây tổn thƣơng đến khả năng tạo chồi
Số lượng chồi được tạo ra trên mẫu cấy không chỉ phụ thuộc vào sự kết hợp nồng độ giữa BAP và NAA mà gây thương tổn là một trong những tác động tạo chồi. Sau khi hạt lạc nảy mầm 7 - 8 ngày cắt bỏ trụ rễ để lại 2 - 3mm, tách đôi lá mầm thành 2 mẫu cấy riêng biệt. Chúng tôi tiến hành thí nghiệm nuôi cấy các mẫu mảnh lá mầm không gây thương tổn và gây thương tổn bằng dao giải phẫu (hình 3.4 (A)), sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trường cảm ứng chồi tốt nhất đối với mỗi giống, kết quả nghiên cứu được thể hiện trong bảng 3.2.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của tác động gây thương tổn đến khả năng tạo chồi trên môi trường cảm ứng tạo chồi tốt nhất
Tác động lên
mẫu Giống
Số chồi/ mẫu cấy Số chồi / mẫu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 38 Không gây thương tổn (50 mẫu) L23 31 6 2 1 0 0 0 0 1,33 L26 30 4 1 0 0 0 0 0 1,17 Gây thương tổn (50 mẫu) L23 0 0 0 2 6 16 12 2 6,16 L26 0 0 0 4 17 10 4 0 5,4
Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy khi không gây thương tổn, từ nách lá mầm thường chỉ phát triển một hoặc hai chồi (hình 3.4 (B)), nhưng khi gây thương tổn bằng dao giải phẫu thì số chồi tạo thành tăng lên rõ rệt 5 – 6 chồi/ 1 mảnh lá mầm, thậm chí có trường hợp là 8 chồi/ 1 mảnh lá mầm (hình 3.4 (C) và (D)). Khả năng tạo đa chồi khi gây tổn thương vùng nách lá mầm cũng được các tác giả Nguyễn Thị Thuý Hường (2009) và Nguyễn Thị Luyện (2009) báo cáo khi tiến hành nghiên cứu trên các đối tượng là cây đậu tương và cây đậu xanh [8], [10]. Chúng tôi đi đến kết luận, tỷ lệ tạo đa chồi khi gây thương tổn bằng dao giải phẫu tăng lên đáng kể so với những mẫu thí nghịêm không gây thương tổn.
A B C
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
39
D E
Hình 3.4. Mảnh lá mầm cảm ứng tạo đa chồi sau khi gây thương tổn và không gây tổn thương
A - Vị trí gây tổn thương ở nách lá mầm (mũi tên) B - Cụm chồi tạo được khi không gây tổn thương
C - Cụm chồi tạo được ở giống L23 sau khi gây tổn thương D - Cụm chồi tạo được ở giống L26 sau khi gây tổn thương E - Cụm đa chồi tạo được sau 6 tuần ở giống L23
3.2.3. Môi trƣờng kéo dài chồi của hai giống lạc
Các chồi có kích thước từ 1 - 1,5cm được tách khỏi cụm chồi và tiếp tục được nuôi cấy trong 2 tuần tiếp theo trên môi trường kéo dài chồi SEM (hình 3.5). Trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành thăm dò môi trường kéo dài chồi trong hai trường hợp là môi trường chỉ có BAP và môi trường có chứa tổ hợp BAP + NAA với các nồng độ phối hợp khác nhau và so sánh với môi trường đối chứng không có chất điều khiển sinh trưởng. Kết quả thí nghiệm chúng tôi thu được trình bày ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của BAP và NAA đến khả năng kéo dài chồi của các giống lạc
BAP NAA số mẫu Giống lạc L23 Giống lạc L26 (mg/l) Tỷ lệ chồi kéo dài (%) Tăng chiều cao TB (cm) Tỷ lệ chồi kéo dài (%) Tăng chiều cao TB (cm) 0 0 30 22,2±1,93 0,6±0,13 21,1±1,91 0,8±0,27 1,5 0 30 28,9±1,93 0,8±0,39 41,1±5,09 1,1±0,42 2,0 0 30 57,8±1,93 1,1±0,29 54,4±1,93 1,2±0,40 2,5 0 30 62,2±1,93 1,2±0,28 75,6±5,09 1,4±0,49 1,5 0,1 30 95,6±3,85 1,4±0,39 78,9±5,09 1,5±0,53 2,0 0,1 30 100±0,00 2,1±0,36 75,6±1,93 1,7±0,40 2,5 0,1 30 72,2±1,93 1,5±0,39 100±0,00 2,5±0,29
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 40 1,5 0,5 30 78,9±1,93 1,7±0,28 76,7±3,33 1,5±0,29 2,0 0,5 30 68,9±6,93 1,5±0,28 78,9±3,85 1,7±0,42 2,5 0,5 30 66,7±3,33 1,5±0,36 87,8±3,85 2,0±0,53 A B C
Hình 3.5. Chồi được tách ra khỏi cụm đa chồi để nuôi kéo dài chồi ở giống lạc L23 A - Cụm chồi mầm sau khi tách chồi chính
B - Các chồi có kích thước từ 1 - 1,5 cm sau khi tách khỏi cụm chồi C - Các chồi được kéo dài sau 2 tuần trên môi trường SEM
Kết quả bảng 3.3 cho thấy cả hai giống lạc đều tỏ ra thính ứng với môi trường chứa tổ hợp BAP và NAA. Môi trường thích hợp để kéo dài chồi đối với giống L23 là môi trường chứa tổ hợp gồm 2mg/l BAP và 0,1mg/l NAA còn đối giống L26 là môi trường chứa tổ hợp 2,5mg/l BAP và 0,1 NAA. Sau 2 tuần nuôi kéo dài, các chồi tăng chiều dài trung bình 2,1 – 2,5 cm. Lúc này các chồi có kích thước tổng thể từ 3 - 4cm, các thân chồi mập, khỏe, xanh tốt đủ điều kiện để chuyển qua khâu tạo rễ. Tác giả Swathi Anuradha (2006) khi tiến hành thí nghiệm kéo dài chồi trong cùng điều kiện môi trường 2mg/l BAP và 0,1mg/l NAA đối với giống lạc JL-24 cũng cho thấy chồi có khả năng kéo dài rất tốt [79].
3.2.4. Môi trƣờng ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh
NAA và IBA đều thuộc nhóm kích thích sinh trưởng auxin có khả năng kích thích rễ phát triển ở nhiều loài thực vật. Trong môi trường ra rễ chúng tôi bổ sung
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
41
NAA hoặc IBA với các nồng độ 0,1; 0,3; 0,5mg/l nuôi cấy trong 4 tuần. Sau 2 tuần đầu, rễ bắt đầu xuất hiện đầu tiên trên môi trường NAA 0,5mg/l và IBA 0,3mg/l ở cả hai giống. Sau 4 tuần rễ được tạo ra ở cả hai giống lạc trên tất cả các môi trường nghiên cứu nhưng chất lượng rễ ở các môi trường không giống nhau (bảng 3.4)
Bảng 3.4. Hiệu quả kích thích ra rễ cho lạc của NAA và IBA
Tác nhân kích thích ra rễ Nồng độ (mg/l) Số mẫu thí nghiệm Giống lạc L23 Giống lạc L26 Tỷ lệ ra rễ (%) Chất lƣợng rễ Tỷ lệ ra rễ (%) Chất lƣợng rễ NAA 0,1 50 90,7±2,31 Xấu 91,3±1,16 Xấu 0,3 50 100±0,00 Tốt 98,7±1,16 Tốt 0,5 50 94,0±2,00 Tốt 92,7±1,16 Tốt IBA 0,1 50 88,7±2,31 Xấu 86,0±2,00 Xấu 0,3 50 92,7±3,06 Tốt 91,3±3,06 Tốt 0,5 50 82,0±3,46 Xấu 87,3±3,06 Tốt
Ghi chú: Chất lượng rễ: - Rễ tốt: Rễ nhiều, dài, mập, có màu trắng, khỏe; - Rễ xấu: Rễ ít, ngắn, còi cọc, có màu vàng
Kết quả nghiên cứu cho thấy cây tạo rễ trên môi trường bổ sung NAA với tỷ lệ trung bình ra rễ cao hơn so với môi trường bổ sung IBA ở cả hai giống lạc. NAA ở nồng độ 0,3mg/l là thích hợp nhất cho sự ra rễ của cả hai giống lạc L23 và L26 với tỷ lệ tạo rễ tốt nhất lần lượt là 100% và 98,7%, số lượng rễ nhiều và mập. Chúng tôi nhận thấy không cần phải bổ sung NAA với nồng độ cao hơn để tạo rễ ở cây lạc. Trong quy trình tái sinh cây lạc in vitro của tác giả Swathi Anuradha (2006) thì nồng độ NAA dùng để tạo rễ được sử dụng với nồng độ cao hơn là 0,8mg/l [79].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn