Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
43
3.3.1. Ảnh hƣởng của nồng độ 2,4D đến khả năng tạo mô sẹo từ phôi lạc
Với mục đích đánh giá khả năng tạo mô sẹo của các giống lạc trong hệ thống nuôi cấy in vitro làm cơ sở cho các nghiên cứu chuyển gen vào lạc, chúng tôi tiến hành thăm dò khả năng tạo mô sẹo từ các tế bào phôi trục của hạt và tốc độ sinh trưởng của mô sẹo của 2 giống lạc nghiên cứu. Phôi trục của hai giống lạc sau khi khử trùng được cấy lên môi trường MS cơ bản bổ sung 2,4D với các nồng độ khác nhau (sử dụng 60 phôi/ mỗi công thức thí nghiệm, tiến hành lặp lại 3 lần). Theo dõi khả năng hình thành mô sẹo sau khi nuôi 1 tuần trong tối và 3 ngày dưới ánh sáng đèn phòng nuôi cấy, chúng tôi thu được kết quả ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của 2,4-D đến khả năng tạo mô sẹo của các giống lạc
Nồng độ 2,4-D (mg/l) L23 L26 Tỷ lệ tạo sẹo (%)
Đặc điểm mô sẹo Tỷ lệ tạo sẹo (%)
Đặc điểm mô sẹo
8 90,0 Bé, nhẵn, có xốp trắng 94,4 Bé, nhẵn, có xốp trắng 10 93,3 Lớn (không đồng đều), nhẵn, có xốp trắng 96,7 Lớn (không đồng đều), nhẵn, có xốp trắng 12 100 Lớn (độ đồng đều cao), nhẵn, ít xốp trắng 99,4 Lớn (độ đồng đều cao), nhẵn, ít xốp trắng 14 98,9 Lớn (đồng đều), nhẵn, nhiều xốp vàng, nâu 97,8 Lớn (đồng đều), nhẵn, nhiều xốp vàng, nâu
Kết quả bảng 3.5 cho thấy, trên các loại môi trường có bổ sung 2,4D với nồng độ khác nhau và giống lạc khác nhau, phôi lạc đều có khả năng tạo mô sẹo sau 7 ngày nuôi cấy trong tối hoàn toàn. Ở môi trường có nồng độ 12 mg/l 2,4D là thích hợp nhất cho khả năng tạo mô sẹo phôi của cả 2 giống. Đối với giống lạc L23 tỷ lệ mô sẹo đạt cao nhất là 100%, còn giống L26 tỷ lệ mô sẹo đạt cao nhất là 99,4%. Ở môi trường có nồng độ 8mg/l – 10mg/l 2,4D tỷ lệ tạo mô sẹo thấp hơn, khi sử dụng nồng độ 2,4D cao hơn 12mg/l khả năng tạo mô sẹo của phôi lạc ở hai giống bắt đầu giảm.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
44
Sau 7 ngày nuôi cấy trong tối hoàn toàn mô sẹo có màu vàng, để ngoài sáng 3 ngày tiếp theo mô sẹo chuyển qua màu xanh. Đặc điểm mô sẹo của hai giống lạc cũng được trình bày trong bảng 3.5. Kết quả bảng 3.5 cho thấy trên các loại môi trường có bổ sung 2,4D với nồng độ khác nhau và giống lạc khác nhau, kích thước và trạng thái mô sẹo cũng khác nhau sau 10 ngày nuôi cấy. Ở môi trường có nồng độ 8mg/l – 10mg/l 2,4-D các mô sẹo có kích thước không đều, phần lớn mô sẹo bé (dài 0,5cm, rộng 0,25cm), nhẵn và xuất hiện mô xốp. Ở môi trường có nồng độ 12mg/l 2,4-D các mô sẹo có kích thước lớn rất đồng đều, mô sẹo nhẵn, không có hoặc có rất ít mô xốp bao quanh. Còn ở môi trường có nồng độ 2,4-D cao hơn (14mg/l) các mô sẹo có kích thước lớn, mô sẹo nhẵn nhưng có nhiều mô xốp màu vàng hoặc nâu bao quanh. Trong quá trình thực nghiệm chúng tôi nhận thấy mô xốp bao quanh mô sẹo không có khả năng tái sinh chồi, chúng chỉ tăng sinh rất nhanh trong quá trình nuôi cấy và làm cản trở quá trình tái sinh chồi của mô sẹo.
Khối lượng mô sẹo của hai giống lạc được trình bày ở bảng 3.6 cho thấy: khối lượng trung bình của mô sẹo đạt cao nhất trên môi trường 2,4-D nồng độ 12mg/l (185mg/mô và 195mg/mô đối với giống L23 và L26) và khối lượng đạt mức thấp nhất ở nồng độ 8mg/l 2,4-D đối với cả 2 giống lạc lần lượt là 105mg/mô (L23) và 152mg/mô (L26).
Bảng 3.6. Khối lượng mô sẹo của các giống lạc ở các mức nồng độ 2,4-D Nồng độ 2,4-D
(mg/l)
Khối lượng mô sẹo sau 10 ngày nuôi cấy (mg/mô) L23 L26 8 105,22 ± 5,32 152,59 ± 5,53 10 155,37 ± 5,79 167,28 ± 6,44 12 185,16 ± 4,54 195,84 ± 4,29 14 182,84 ± 8,36 189,73 ± 6,25
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
45
A B
Hình 3.7. Hình ảnh mô sẹo phôi lạc sau 10 ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung 12mg/l 2,4D của giống L23 (A) và L26 (B)
Tỷ lệ tạo mô sẹo, tốc độ sinh trưởng mô sẹo biểu hiện mức độ đáp ứng của phôi lạc đối với các mức nồng độ 2,4-D khác nhau. Các kết quả thu được ở bảng 3.5 và bảng 3.6 cho thấy môi trường bổ sung 12mg/l 2,4D là môi trường thích hợp nhất cho khả năng tạo mô sẹo đối với cả 2 giống lạc L23 và L26 vì ở môi trường này tỷ lệ tạo mô sẹo cao nhất, mô sẹo có rất ít mô xốp, khối lượng, kích thước mô sẹo lớn với độ đồng đều cao, đáp ứng cho các thí nghiệm tiếp theo (hình 3.7). Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với các kết quả nghiên cứu trước đó của các tác giả Nguyễn Thị Tâm (2006) và Vũ Thị Thu Thủy (2009) khi nghiên cứu tạo mô sẹo trên đối tượng phôi trục lạc [13], [15].
3.3.2. Ảnh hƣởng của BAP đến khả năng tái sinh cây từ mô sẹo phôi lạc
BAP là chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin nó ảnh hưởng rõ rệt và rất đặc trưng lên sự phân hoá cơ quan của thực vật, đặc biệt là sự phân hoá chồi. BAP được sử dụng rộng rãi cho cảm ứng chồi trên các loại cây họ đậu [20], nó có thể tác động khi ở trạng thái đơn lẻ hoặc phối hợp với các chất thuộc nhóm auxin để tác động lên sự phân hóa chồi của thực vật. Chúng tôi đã nghiên cứu sự tái sinh mô sẹo phôi trên 2 loại môi trường là môi trường chỉ chứa BAP với các nồng độ 1,5mg/l; 2mg/l; 2,5mg/l; 3mg/l và môi trường chứa BAP có bổ sung thêm 0,1mg/l NAA. Mô sẹo của các giống lạc trên môi trường cảm ứng mô sẹo tốt nhất
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
46
được cấy chuyển lên các loại môi trường tái sinh, ngoài ra mô sẹo còn có thể được chẻ thành những khối mô sẹo nhỏ theo tỷ lệ ½ và ¼ rồi cấy lên môi trường tái sinh. Mỗi công thức được tiến hành trên 30 mô sẹo, lặp lại 3 lần, kết quả thu được thể hiện ở bảng 3.7.
Kết quả thu được ở bảng 3.7 cho thấy ở trạng thái ½ mô sẹo tái sinh tốt nhất trên môi trường tái sinh. Mô sẹo sau khi bị chẻ làm 2 phần được cấy úp lên môi trường tái sinh, chỉ sau hai tuần nuôi cấy đã tái sinh được chồi có hình thái bình thường với kích thước từ 2cm – 2,5cm, tỷ lệ tái sinh chồi trung bình trên các loại môi trường là 68,3(%) (đối với giống lạc L23) và 68,8(%) (đối với giống lạc L26). Trong khi đó nếu mô sẹo bị chẻ làm tư hoặc để nguyên khối thì tỷ lệ tái sinh trung bình thấp hơn lần lượt là 41,1(%) và 18,5(%) (đối với giống lạc L23); 46,4(%) và 19,6(%) (đối với giống lạc L26). Sau 4 tuần nuôi cấy tỷ lệ tái sinh chồi đều tăng lên trên các loại mô sẹo ở cả hai giống lạc. Cụ thể trên mô sẹo nguyên khối, mô sẹo chia hai, mô sẹo chia bốn của giống lạc L23 lần lượt là 69,7(%), 79,2(%), 70(%) và trên giống lạc L26 lần lượt là 67,1(%), 80,6(%) và 71,5(%). Kết quả ở bảng 3.7 cũng cho thấy dưới ảnh hưởng của BAP và tổ hợp của BAP với NAA, tỉ lệ tái sinh cây của cả 2 giống lạc khá cao sau 4 tuần, trong đó tỉ lệ tái sinh cây ở cả 2 giống thấp nhất dao động từ 56,7% - 70% trên môi trường có nồng độ BAP 1,5mg/l và cao nhất dao động từ 73,3% - 96,7% khi nồng độ BAP là 2mg/l. Bổ sung nồng độ BAP cao hơn (3mg/l) hoặc kết hợp BAP với NAA (0,1mg/l) không làm tăng tỷ lệ tái sinh ở cây lạc mà còn giảm tỷ lệ tái sinh ở 2 giống (63,3% - 77,8%).
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của BAP và tổ hợp BAP với NAA đến tỷ lệ tái sinh chồi từ mô sẹo của các giống lạc (%)
BAP NAA L23 L26
Trạng thái mô sẹo (mg/l) Để nguyên Chẻ làm đôi Chẻ làm tƣ Để nguyên Chẻ làm đôi Chẻ làm tƣ Sau 2 tuần 1,5 0 12,2 ±4,8 54,4±9,6 32,2±4,8 13,3±8,3 63,3±9,6 33,3±8,3 2 0 26,7±8,3 85,6±4,8 51,1±4,8 26,7±8,3 83,3±4,8 56,7±4,8
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 47 2,5 0 17,8 ±4,8 71,1±12,6 40,0±8,3 21,1±4,8 66,7±8,3 51,1±12,6 3 0 16,7±8,3 62,2 ±4,8 35,6±9,6 15,6±4,8 60±12,6 46,7±12,6 1,5 0,1 15,6±4,8 68,9±4,8 42,2±9,6 16,7±8,3 63,3±4,8 50,0±8,3 2 0,1 24,4 ±4,8 77,8±9,6 45,6±4,8 23,3±8,3 76,7±4,8 50,0±8,3 2,5 0,1 17,8±4,8 71,1±9,6 38,9±9,6 23,3±4,8 70,0±8,3 40,0±12,6 3 0,1 16,7±8,3 55,6±12,6 43,3±8,3 16,7±4,8 66,7±9,6 43,3±8,3 Sau 4 tuần 1,5 0 60,0±9,6 66,7±4,8 56,7±4,8 60,0±8,3 70,0±8,3 63,3±4,8 2 0 76,7±8,3 96,7±4,8 80,0±4,8 73,3±8,3 93,3±4,8 73,3±4,8 2,5 0 68,9±12,6 80,0±8,3 66,7±4,8 66,8±12,6 80,0±8,3 70,0±8,3 3 0 70,0±4,8 66,7±8,3 73,3±4,8 63,3±4,8 77,8±9,6 66, 7±4,8 1,5 0,1 68,9±9,6 70,0±8,3 63,3±8,3 63,3±12,6 73,3±4,8 68,9±17,2 2 0,1 73,3±4,8 90,0±4,8 76,7±9,6 73,3±4,8 86,7±8,3 76,7±9,6 2,5 0,1 73,3±8,3 83,3±8,3 70,0±8,3 70,0±8,3 86,7±9,6 80,0±8,3 3 0,1 66,7±8,3 80,0±4,8 73,3±4,8 66,7±4,8 76,7±4,8 73,3±4,8
Một điều đáng chú ý là chồi được tái sinh trên các mô sẹo nguyên khối thường có chiều cao thấp hơn (chỉ cao từ 1,5cm - 2cm) so với chồi được tái sinh từ 1/2 mô sẹo (cao từ 2,5cm – 3,5cm) và chồi tái sinh trên 1/4 mô sẹo thường mảnh và yếu nhất. Điều này xảy ra có thể là do khi mô sẹo bị chẻ làm hai sẽ được tiếp xúc trực tiếp với bề mặt môi trường nuôi cấy tốt hơn khi mô sẹo để nguyên và nó nhanh chóng hấp thụ các chất dinh dưỡng để tái sinh chồi và chồi cao lớn hơn nhiều so với chồi được tái sinh ở mô sẹo nguyên khối cùng thời điểm, còn khi mô sẹo bị chẻ làm tư thì mức độ bị tổn thương của các tế bào mô sẹo lớn hơn, thể tích của vùng tế bào kiến tạo chồi bị thu hẹp do đó chồi được tái sinh thường mảnh và yếu hơn so với chồi được tái sinh từ 1/2 mô sẹo và mô sẹo nguyên khối (hình 3.8).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
48
A B C
Hình 3.8. Hình ảnh chồi tái sinh trên mô sẹo sau 2 tuần nuôi cấy A - Chồi tái sinh trên mô sẹo nguyên khối
B - Chồi tái sinh trên 1/2 mô sẹo C - Chồi tái sinh trên 1/4 mô sẹo
Khả năng tái sinh và số chồi / mô sẹo được dùng để đánh giá ảnh hưởng của BAP và tổ hợp BAP với NAA đến hiệu quả tái sinh của các giống lạc nghiên cứu. Kết quả thí nghiệm tạo chồi được thể hiện ở bảng 3.8. Kết quả thể hiện ở bảng 3.8 cho thấy sau 4 tuần tái sinh khả năng tạo chồi trên 1/4 mô sẹo là thấp nhất, nồng độ khác nhau của các chất điều hòa sinh trưởng không ảnh hưởng đến khả năng tạo chồi trên 1/4 mô sẹo, hầu hết chỉ có 1 chồi được tạo ra trên 1/4 mô sẹo tái sinh mà thôi. Khi ở cùng một môi trường tái sinh, số chồi trung bình được tạo ra trên mô sẹo nguyên khối và ½ mô sẹo không có sự chênh lệch đáng kể. Khi sử dụng BAP nồng độ 1,5mg/l hoặc kết hợp BAP (1,5mg/l) với NAA (0,1mg/l) thì số lượng chồi tạo ra trên mô sẹo nguyên khối và 1/2 mô sẹo là thấp nhất dao động từ 1- 1,3 chồi / 1 mô sẹo. Còn khi sử dụng BAP với nồng độ từ 2mg/l trở lên hoặc kết hợp chúng với NAA (0,1mg/l) thì số lượng chồi trung bình tạo ra trên mô sẹo nguyên khối và 1/2 mô sẹo là cao hơn, dao động từ 1,4 – 1,9 chồi / 1 mô sẹo. Từ các kết quả nghiên cứu thu được ở trên chúng tôi kết luận rằng mô sẹo ở trạng thái ½ (mô sẹo chẻ đôi theo chiều dọc) thể hiện khả năng tái sinh tốt nhất, nồng độ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
49
BAP 2mg/l là tốt nhất cho sự tái sinh cây từ mô sẹo của 2 giống lạc nghiên cứu, khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo của hai giống không có sự khác biệt đáng kể nào.
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của BAP và tổ hợp BAP với NAA đến khả năng tạo chồi ở mô sẹo lạc sau 4 tuần tái sinh
BAP (mg/l)
NAA (mg/l)
Số chồi / một mô sẹo
L23 L26 Để nguyên Chẻ làm đôi Chẻ làm tƣ Để nguyên Chẻ làm đôi Chẻ làm tƣ 1,5 0 1,2±0,10 1,2±0,10 1,0±0,00 1,3±0,11 1,2±0,10 1,1±0,09 2,0 0 1,8±0,15 1,6±0,10 1,1±0,07 1,7±0,17 1,5±0,10 1,1±0,07 2,5 0 1,8±0,15 1,4±0,10 1,1±0,05 1,9±0,16 1,6±0,10 1,2±0,09 3,0 0 1,9±0,18 1,4±0,13 1,1±0,06 1,9±0,18 1,7±0,13 1,2±0,07 1,5 0,1 1,3±0,15 1,2±0,09 1,1±0,05 1,3±0,18 1,3±0,11 1,1±0,07 2,0 0,1 1,7±0,16 1,4±0,11 1,1±0,07 1,9±0,16 1,7±0,12 1,1±0,07 2,5 0,1 1,7±0,15 1,5±0,09 1,2±0,09 1,8±0,14 1,7±0,10 1,2±0,07 3,0 0,1 1,7±0,17 1,5±0,12 1,2±0,09 1,9±0,16 1,6±0,13 1,2±0,09
3.3.3. Môi trƣờng tạo rễ của chồi tái sinh từ mô sẹo
Hệ rễ được hình thành và phát triển tốt ở cả 2 giống sau 4 tuần cấy chuyển các chồi sang môi trường ra rễ có bổ sung NAA 0,3 mg/l. Tỷ lệ ra rễ của giống L23 và L26 lần lượt là 98% và 96,7%.
3.3.4. Nhận xét về môi trƣờng tái sinh cây lạc từ mô sẹo phôi
(1) Môi trường thích hợp nhất cho tạo mô sẹo của phôi mầm lạc là môi trường MS có bổ sung 12 mg/l 2,4D đối với cả 2 giống L23 và L26.
(2) Các mô sẹo từ phôi trục hạt của hai giống lạc đều có khả năng tái sinh cây. Khả năng tái sinh chồi mạnh nhất khi tái sinh trên 1/2 mô sẹo. Tỷ lệ tái sinh, số chồi trung bình và kích thước chồi cao nhất trên môi trường MS bổ sung BAP với nồng độ 2mg/l. Khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo không có sự khác biệt ở hai giống.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
50
(3) Môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh là môi trường MS có bổ sung 0,3 mg/l NAA, thời gian ra rễ là 4 tuần.
(4) Tổng thời gian dành cho quy trình tái sinh cây hoàn chỉnh từ mô sẹo phôi trục ở cả hai giống lạc tính từ khi tạo mô sẹo đến khi cây hoàn thiện bộ rễ là 9 tuần.
3.4. KẾT QUẢ TÁI SINH THÔNG QUA SỰ HÌNH THÀNH PHÔI SOMA
3.4.1. Môi trƣờng tạo cảm ứng cụm phôi soma của phôi trục hạt lạc
Tái sinh thông sự hình thành phôi soma đã được tiến hành thực nghiệm ở nhiều loài thực vật bao gồm cả lạc. Cho đến nay nhiều loại mô cấy đã được sử dụng để cảm ứng phôi soma ở lạc, bao gồm: Lá của cây non [22], [82]; phôi non hạt lạc [60], phôi trục [14], [77]; lá chét của phôi trục [34], [77], [84]; trụ dưới lá mầm [83]... Các báo cáo đều đưa ra một kết luận rằng khả năng cảm ứng phôi soma của mẫu mô cấy chịu ảnh hưởng lớn của nồng độ 2,4-D.
Phôi trục của hai giống lạc sau khi được tách ra từ hạt đã khử trùng (mục 2.2.1.1) và ngâm trong nước cất vô trùng 12-16h sau đó được khử trùng lại một lần nữa bằng thủy ngân clorua 0,1% trong 3 phút, tráng sạch từ 4 - 5 lần bằng nước cất khử trùng rồi cấy trên môi trường tiền cảm ứng phôi soma PM (bảng 2.2) có chứa nồng độ khác nhau của 2,4-D (0-30 mg/l) để cảm ứng phôi soma (sử dụng 50 phôi/ mỗi công thức thí nghiệm). Theo dõi khả năng cảm ứng phôi soma sau khi nuôi 1 tuần trong tối và 5 tuần dưới ánh sáng đèn phòng nuôi cấy, chúng tôi thu được kết quả ở bảng 3.9.
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của nồng độ khác nhau của 2,4-D đến khả năng cảm ứng tạo phôi soma của các giống lạc
2,4-D (mg/l) L23 L26 Tỷ lệ cảm ứng phôi (%) Số phôi soma TB/ mẫu cấy Tỷ lệ cảm ứng phôi (%) Số phôi soma TB/ mẫu cấy 0 0 0 0 0 10 80,7 ± 3,05 11,8 ± 0,22 76,0 ± 2,0 10,3 ± 0,32 20 91,3 ± 1,16 16,7 ± 0,28 86,7 ± 3,05 14,3 ± 0,32
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
51
30 73,3 ± 1,16 6,2 ± 0,32 67,3 ± 2,31 7,7 ± 0,22
Kết quả thể hiện trong bảng 3.9 cho thấy ở môi trường cảm ứng không có 2,4-D phôi trục đã không có sự cảm ứng tạo phôi soma, trong khi môi trường có 2,4-D ở các mức 10, 20 và 30mg/l thì đã cảm ứng phôi ở cả 2 giống thử nghiệm, tỷ lệ cảm ứng phôi soma của phôi trục cao nhất ở môi trường 2,4-D có nồng độ