Một phương thức tái sinh tốt là một điều kiện tiên quyết để đạt được thành công trong các nghiên cứu chuyển đổi di truyền. Vì tái sinh thành công của cây chuyển gen phụ thuộc vào hiệu quả của vi nhân in vitro và phương thức chuyển gen [75]. Việc nghiên cứu chuyển gen ở cây lạc cũng sẽ khó thành công
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
16
nếu trước hết không tiến hành việc tái sinh hoàn chỉnh cây lạc. Nhiều khó khăn trong chuyển đổi di truyền ở lạc bao gồm các yếu tố như: tái sinh kém, thời gian tái sinh dài, thường thông qua một giai đoạn mô sẹo, và chịu ảnh hưởng của kiểu gen trên các hệ thống tái sinh... vì vậy một phương pháp tái sinh có thể tránh những vấn đề này là cần thiết [27].
Tái sinh cây lạc thông qua sự hình thành phôi soma đã được thử nghiệm trên các loại mô cấy như: Lá của cây non [22], [55], [82]; phôi non hạt lạc [60]; phôi trục [56]; lá chét của phôi trục [34], [85]; trụ dưới lá mầm [83],... Trong số các chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin được sử dụng cho cảm ứng sinh phôi soma đậu phộng, 2,4-D tỏ ra là có hiệu quả nhất và nó đã được sử dụng thường xuyên cho cảm ứng phôi soma. Venkatachalam (1997, 1999), khi nghiên cứu sự tạo thành phôi từ nuôi cấy các lá chét và trụ dưới lá mầm tách ra từ cây giống đậu phộng khi có sự hiện diện của một trong hai chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin là 2,4-D và NAA trong môi trường nuôi cấy đã báo cáo rằng đối với sự cảm ứng phôi cũng như sản xuất phôi soma thì 2,4-D là hiệu quả hơn [82], [83]. Tuy nhiên trong hầu hết các nghiên cứu đã được báo cáo thì sự chuyển đổi phôi soma thành cây con là khá thấp do sự xuất hiện hình thái bất thường tại vùng mô phân sinh đỉnh của phôi soma, điều này dẫn đến việc bị hạn chế sử dụng tái sinh thông qua phôi soma trong các nghiên cứu chuyển đổi di truyền [88]. Mặc dù vậy đây vẫn là một trong những phương pháp tái sinh đầy hứa hẹn có thể phục vụ rất tốt cho các nghiên cứu chuyển đổi di truyền ở cây lạc.
Để tăng tần số phục hồi cây hay khắc phục tỷ lệ chuyển đổi nghèo nàn của phôi soma thành cây con, các nỗ lực đã được thực hiện bằng cách cho các phôi nảy mầm trên môi trường nảy mầm , sau đó kích thích sự hình thành chồi từ đọt cây non của phôi bằng cách bổ sung BAP và KIN [14], [35] hoặc BAP và NAA [82], [83], [86]. Trong báo cáo của mình, Chengalrayan (1997) đã thu được kết quả là 92% cây được phục hồi từ phôi soma có hình thái bất thường khi bổ sung TDZ trong môi trường MS cơ bản và để cho rễ phôi soma tiếp xúc với TDZ, cây
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
17
phục hồi có hình thái rễ còi cọc và chồi có lá không mở rộng hoàn toàn, tổng thời gian quy trình tái sinh là 28-32 tuần (tương đương 7-8 tháng) [36]. Tác giả Bùi Văn Thắng và cộng sự (2004) sau khi thí nghiệm nuôi cấy phôi trục hạt lạc trên môi trường 2,4-D cũng đã tạo ra được phôi soma phát triển bình thường với tỷ lệ rất thấp là 1,4%, phần lớn phôi còn lại phát triển dị thường. Sau đó tác giả đã tiến hành phục hồi được 82% các phôi soma nảy mầm bị dị thường khi sử dụng môi trường phục hồi chứa tổ hợp chất điều khiển sinh trưởng gồm 2mg/l BAP và 3mg/l kinetin [14]. Trong hầu hết các thí nghiệm về tái sinh thông qua hình thành phôi soma đậu phộng trước đây, các tác giả mới chỉ nghiên cứu sự ảnh hưởng của nồng độ 2,4D đến khả năng cảm ứng phôi soma của mô cấy mà không thử nghiệm hiệu quả của thời gian ủ mẫu trên môi trường cảm ứng phôi (chứa 2,4D), để từ đó xem xét mức độ ảnh hưởng của thời gian ủ mẫu đến hình thái phôi và sự chuyển đổi của phôi soma thành cây con. Các mẫu cấy chỉ được nuôi cấy theo một thời gian mặc định là trong 4 tuần [23], [34], [36], [40], [82], [83], [86]. Sau này, tác giả Raghavan (2005) phát hiện ra rằng: tùy vào thời gian tiền xử lý mẫu cấy với 2,4- D, các phôi soma được tạo thành biểu hiện hình thái khác nhau trong quá trình tăng trưởng tiếp theo trong môi trường cơ bản. Tác giả đã kết luận, thời gian xử lý tối ưu của 2,4-D cũng thúc đẩy sự trưởng thành của phôi soma để hình thành chồi một cách bình thường [66]. Filippov (2006) cũng báo cáo rằng thời gian tiếp xúc với auxin có ảnh hưởng đáng kể đến tính hiệu quả của tạo phôi soma phát triển bình thường [43]. Tác giả Shweta Singh (2009) đã tái sinh hoàn chỉnh cây lạc từ phôi soma phát triển bình thường được tạo ra trên các đối tượng lá chét, và vùng mô phân sinh nách chồi mầm phôi trục hạt lạc với tần suất tương đối cao lần lượt là 53% và 32,3% sau khi tăng thời gian tiếp xúc ban đầu (tiền cảm ứng phôi soma) của mẫu cấy với 2,4-D lên 6 tuần so với 4 tuần trong các quy trình trước đây của Chengalrayan (1997). Tác giả kết luận rằng ủ lá chét và vùng mô phân sinh nách phôi trục hạt lạc trên môi trường cảm ứng phôi soma (chứa 2,4-D nồng độ 20mg/l) trong 6 tuần và nuôi cấy tiếp trên môi trường phát triển phôi ( chứa 2,4-D nồng độ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
18
3mg/l) là tối ưu để hình thành và thúc đẩy sự phát triển phôi soma có sinh lý bình thường. Cây con với chồi và rễ hoàn chỉnh được khôi phục chỉ thông qua 3 bước: tiền cảm ứng phôi soma, phát triển phôi và nảy mầm phôi mà không có sự tham gia của bất kỳ cytokinin trong môi trường nuôi cấy. Sau khi thử nghiệm, tỷ lệ phôi có hình thái bất thường giảm xuống, quy trình tái sinh in vitro được rút ngắn xuống chỉ còn 22 tuần. Đây là một điều rất có ý nghĩa vì việc giảm bớt các khâu cấy chuyển trung gian giúp hạn chế phát sinh các biến dị trong vật chất di truyền của đối tượng nghiên cứu. Tác giả cũng đã khẳng định, tối ưu nồng độ và thời gian tiếp xúc với auxin là quan trọng cho sự hình thành và phát triển của phôi soma [77].
Gần đây, việc nghiên cứu tái sinh cây lạc in vitro thường được tiến hành trên các loại mô cấy là: lá mầm, mắt lá mầm, phôi trục, lá non thông qua con đường tái sinh trực tiếp do có lợi thế là nhanh chóng hình thành phôi, chồi và không yêu cầu phải cấy chuyển thường xuyên. Hệ thống tái sinh trực tiếp này được ưu tiên vì khả năng tiếp cận dễ dàng và thuận lợi cho việc chuyển đổi di truyền qua trung gian A. Tumefaciens. Trong các hướng nghiên cứu đó, Venkatachalam (2000) sử dụng lá mầm như một nguồn mô cấy đã đạt được tần số cao (86%) trong việc chuyển đổi phôi soma thành cây đậu phộng [86], [87]. Sharma và Anjaiah (2000) cũng đã thành công khi thu được tần số cao (90%) tái sinh chồi trực tiếp từ nuôi cấy lá mầm trưởng thành của các giống lạc khác nhau [75]. Tuy nhiên hệ thống tái sinh thành công nhất trong các loại cây họ đậu dẫn đến sự phục hồi tốt của cây chuyển gen được ghi nhận chính là tái sinh chồi từ mắt lá mầm và phôi trục của hạt [20], trong đó mắt (nách) lá mầm đã được xem là thành công hơn đối với sự cảm ứng đa chồi thông qua sự phát sinh cơ quan trực tiếp trong số các loại cây họ đậu [31]. Swathi Anuradha (2006) đã thành công trong việc tái sinh đa chồi trực tiếp từ các mắt lá mầm của giống lạc JL-24 với tỷ lệ tái sinh là 82%, trung bình thu được 6 chồi/ 1 mẫu cấy [79]. Nuôi cấy nách lá mầm và phôi trục có thể cho một tần số tái sinh trực tiếp tương đối cao bởi vì những mẫu cấy này có mô phân sinh đỉnh hoặc
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
19
nách là nguồn dự trữ các tế bào toàn năng và được coi là những mục tiêu tốt nhất để chuyển gen. Có thể nói đây là đối tượng nuôi cấy rất có tiềm năng để tái sinh cây hoàn chỉnh so với nuôi cấy các loại mô khác.