(SEB2) ở liều tiêm 1xLD50 lên chuột
Bảng 3.3. So sánh số chuột chết sau tiêm SEB1 và SEB2 ở liều 1xLD50
Nhóm Số chuột chết/tổng
số chuột
Số chuột chết (%)
Nhóm 1 (tiêm ActD) 0/10 0
Nhóm 2 (tiêm ActD và SEB2 = 1xLD50) 0/10 0 Nhóm 5 (tiêm ActD và SEB1 = 1xLD50) 6/10 60
Kết quả bảng 3.3 cho thấy ở liều tiêm 1xLD50 (2,5 µg/g) của dung dịch SEB1 khi phối hợp với Actinomycin D liều 0,5 µg/g thì có 60% số chuột chết sau tiêm (nhóm 5) và không xuất hiện chuột chết ở hai nhóm còn lại (nhóm 1 tiêm Actinomycin D và nhóm 2 tiêm Actinomycin D kết hợp SEB2 ở liều 1x LD50).
3.4.2. Đánh giá độc tính giữa SEB tự nhiên (SEB1) và SEB đột biến (SEB2) ở liều tiêm 3xLD50 và 10xLD50 (SEB2) ở liều tiêm 3xLD50 và 10xLD50
Để kiểm tra xem liều lượng bao nhiêu có thể gây chết hoàn toàn đối với SEB tự nhiên và với liều lượng nào có thể gây ảnh hưởng hoàn toàn với SEB đột biến chúng tôi đã nâng liều tiêm lên tới 3xLD50 và 10xLD50.
Bảng 3.4. So sánh số chuột chết sau tiêm SEB1 và SEB2 ở liều 3xLD50 và 10xLD50 Nhóm Số chuột chết/tổng số chuột Số chuột chết (%) Nhóm 1 (tiêm ActD) 0/10 0
Nhóm 3 (tiêm ActD và SEB2 = 3xLD50) 0/10 0 Nhóm 4 (tiêm ActD và SEB2 = 10xLD50) 0/10 0 Nhóm 6 (tiêm ActD và SEB1 = 3xLD50) 10/10 100
Kết quả bảng 3.4 cho thấy khi nâng liều tiêm tới 10xLD50 với Actinomycin D liều 0,5 µg/g dung dịch SEB2 vẫn không gây chết chuột; trong khi dung dịch SEB1 chỉ cần tiêm ở liều 3xLD50 với Actinomycin D liều 0,5 µg/g đã làm chết 100% số chuột thử nghiệm (nhóm 6).
3.4.3. Biến động số lƣợng chuột nghiên cứu của mỗi nhóm trong 7 ngày
Hình 3.8. Hình dõi biến động số chuột theo ngày của các nhóm nghiên cứu
Kết quả hình 3.7 và 3.8 cho thấy ở các nhóm 1, nhóm 2, nhóm 3 và nhóm 4 không thấy xuất hiện chuột chết sau tiêm chất thử nghiệm trong 7 ngày theo dõi. Nhóm 5 bắt đầu xuất hiện chuột chết từ ngày thứ 2 và ngày thứ 3, từ ngày thứ 4 không có thêm chuột chết; tổng số chuột chết của nhóm 5 là 6/10 bằng 60% (ứng với liều tiêm 1xLD50). Nhóm 6 bắt đầu xuất hiện chuột chết từ ngày thứ 2 và ngày thứ 3, tổng số chuột chết của nhóm 6 là 10/10 bằng 100%. Theo các nghiên cứu trước cho biết, với các động vật nhỏ như chuột nhắt trắng trong phòng thí nghiệm, không thể tiêm với lượng lớn dung dịch thử nghiệm vì sẽ làm phù phổi và suy tạng gây chết động vật trước khi đánh giá độc tính, cần phải phối hợp với Actinomycin D để giảm liều và giảm lượng dung dịch thử nghiệm đưa vào cơ thể chuột. Actinomycin D với liều 0,5 µg/g cân nặng không gây chết chuột thí nghiệm nhưng giúp làm tăng tính độc và giảm liều của chất thử nghiệm 100 lần so với khi dùng đơn độc chất thử nghiệm [28]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng Actinomycin D kết hợp với dung dịch SEB1 và SEB2 và đã tìm được liều lượng thích hợp đưa vào cơ thể chuột để đánh giá khách quan độc tính của 2 dung dịch trên.
Từ các kết quả trên cho thấy dung dịch protein tái tổ hợp SEB2 không gây chết chuột ở mức liều tương đương 10xLD50 trong khi dung dịch SEB1 gây chết 60% động vật thí nghiệm ở mức liều 1xLD50 và làm chết 100 % động vật thí nghiệm ở mức liều 3xLD50.
3.5. Đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch trên chuột của kháng nguyên Staphylococcal enterotoxin B
3.5.1. Gây đáp ứng miễn dịch trên chuột Balb/C
Để chuẩn bị cho việc gây đáp ứng miễn dịch trên chuột cái Balb/C nhằm tạo ra kháng thể đa dòng phục vụ cho việc đánh giá tính kháng nguyên của protein tái tổ hợp SEB, chúng tôi tiến hành lựa chọn 20 chuột cái Balb/C thuần chủng (4 tuần tuổi) khỏe mạnh, đồng đều nhau về trọng lượng và đặc biệt là không nhiễm độc tố SEB được chia làm 2 lô thí nghiệm, mỗi lô 10 con. Các bước gây đáp ứng miễn dịch được thực hiện như sau: Kháng nguyên SEB sau khi được tinh sạch qua cột Niken được trộn với tá dược toàn phần FCA (Complete Freund Adjuvant) rồi tiêm vào dưới da chuột với mỗi lần tiêm là 30 µg cho một con chuột và được tiêm nhắc lại 4 lần vào các ngày 1; 5; 10 và ngày 20. Sau 4 tuần chúng tôi tiến hành thu máu chuột, ly tâm loại các tế bào máu, thu huyết thanh và tiến hành kiểm tra nhận mặt đặc hiệu kháng nguyên của kháng thể có trong huyết thanh bằng kỹ thuật Western blot.
3.5.2. Kết quả kiểm tra khả năng gây đáp ứng miễn dịch trên chuột của kháng nguyên
Chúng tôi sử dụng phương pháp Western blot để phát hiện kháng thể mong muốn phù hợp kháng nguyên SEB trong nhóm chuột thí nghiệm. Các kháng nguyên này có khối lượng phân tử rõ ràng, được phân tách bằng SDS- PAGE và được thấm lên màng PVDF để cố định băng vạch của kháng nguyên SEB. Sau đó các vạch của kháng nguyên đã biết được phân tách và được dò
với mẫu nghi ngờ chứa kháng thể đặc hiệu cho một hay nhiều kháng nguyên đó. Phản ứng của kháng thể với vạch đó được phát hiện bằng kháng thể thứ cấp liên kết enzym đặc hiệu cho tính chuyên biệt của kháng thể trong mẫu thử nghiệm.
Để kiểm tra khả năng bắt cặp của kháng nguyên SEB với kháng thể sinh ra ở chuột, chúng tôi tiến hành hai thí nghiệm dựa trên nguyên tắc chung của phương pháp Western blot.
Thí nghiệm 1: Thử khả năng bắt cặp kháng nguyên SEB với kháng huyết thanh chuột.
Kháng nguyên SEB là kháng nguyên mong muốn được tiêm vào chuột để tạo được kháng thể phù hợp chống lại kháng nguyên. Sau 4 tuần gây miễn dịch, lấy máu chuột rồi tiến hành ly tâm thu kháng huyết thanh, sau đó cho thử khả năng bắt cặp với kháng nguyên SEB và kháng nguyên Salmonella. Lý do chúng tôi chọn kháng nguyên Salmonella cho phản ứng với kháng huyết thanh kháng SEB vì:
+ Thứ nhất Salmonella là một trong những loại vi khuẩn đứng hàng đầu về gây ngộ độc thực phẩm trên toàn thế giới và Việt Nam
+ Thứ hai là do hiện tại kháng nguyên Salmonella chuẩn chúng tôi đang sẵn có nên tạo điều kiện thuận lợi cho việc tiến hành thí nghiệm. Vì vậy kháng nguyên Salmonella được lựa chọn làm mẫu so sánh để đánh giá tính đặc hiệu của kháng nguyên SEB. Kết quả của thí nghiệm 1 được chỉ ra trên hình 3.9.
Hình 3.9. Phản ứng Western blot của protein tái tổ hợp SEB với kháng huyết thanh chuột
M: Maker
1: Kháng nguyên SEB
2: Kháng nguyên Salmonella
Kết quả trên hình 3.9 cho thấy kháng huyết thanh chuột được gây miễn dịch với kháng nguyên SEB chỉ cho bắt cặp đặc hiệu với kháng nguyên SEB (giếng 1) mà không bắt cặp với kháng nguyên Salmonella (giếng 2).
Thí nghiệm 2: Từ kết quả trên, chúng tôi tiếp tục tiến hành thí nghiệm 2 cũng dựa trên nguyên lý của phản ứng Western blot nhằm tìm ra nồng độ kháng nguyên phù hợp cho phản ứng nhận biết kháng nguyên SEB của kháng huyết thanh chuột theo tiêu chí tối ưu và tối thiểu để vừa nhận biết được kháng nguyên vừa tiết kiệm nguyên liệu.
Chuẩn bị thí nghiệm:
Marker màu của Fermentas
Kháng thể pha loãng khoảng 300 lần.
28 kDa
35 kDa 25 kDa 15 kDa
Kháng nguyên SEB tái tổ hợp pha loãng ở các nồng độ: 240 ng/giếng; 480 ng/giếng; 1200 ng/giếng; 2400 ng/giếng.
Kết quả của thí nghiệm 2 được thể hiện trong hình 3.10
Hình 3.10. Phản ứng Western bot của các nồng độ kháng nguyên SEB
khác nhau với tỉ lệ kháng thể pha loãng 1/300 lần
M: Marker màu của Fermentas
1: 240 ng/giếng
2: 480 ng/giếng
3: 1200 ng/giếng
4: 2400 ng/giếng
Từ kết quả thí nghiệm 2 ta nhận thấy, kháng huyết thanh chuột được gây miễn dịch bằng kháng nguyên SEB cho khả năng nhận biết kháng nguyên ở nồng độ tối thiểu là 240 ng/giếng với độ pha loãng kháng huyết thanh là 300 lần.
Như vậy, với kết quả thí nghiệm này có thể sử dụng kháng nguyên SEB tinh sạch để tạo kháng thể đơn dòng phục vụ cho việc chế tạo que thử nhanh ở giai đoạn sau.
KẾT LUẬN
1. Gen seb đột biến được biểu hiện thành công trong tế bào E. coli
BL21(DE3.
2. Đã tinh sạch và định lượng được protein tái tổ hợp SEB với nồng độ TB là 1,278 (mg/ml).
3. Độc tố của protein SEB dạng đột biến không gây chết chuột ở mức liều tương đương 25 µg/g trong khi dung dịch SEB tự nhiên gây chết 60% động vật thí nghiệm ở mức liều 2,5 µg/g và làm chết 100% động vật thí nghiệm ở mức liều 7,5 µg/g.
4. Gây đáp ứng miễn dịch thành công trên chuột. Với kháng huyết thanh chuột được gây miễn dịch bằng kháng nguyên SEB cho khả năng nhận biết kháng nguyên ở nồng độ tối thiểu là 240 ng và độ pha loãng kháng huyết thanh là 300 lần.
KIẾN NGHỊ
Trên cơ sở kết quả tinh sạch và đánh giá tính kháng nguyên của protein tái tổ hợp Staphylococcal enterotoxin B (SEB) chúng ta có thể tiếp tục nghiên cứu tạo kháng thể đơn dòng chuẩn bị cho việc tạo kít phát hiện nhanh ngộ độc thực phẩm do độc tố ruột nhóm B của vi khuẩn S. aureus gây ra.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu Tiếng Việt
1. Phan Thị An và cs, Khảo sát tình hình nhiễm vi khuẩn của một số loại
thức ăn đường phố tại thành phố Đà Lạt. Cục An toàn vệ sinh thực phẩm -
www.vfa.gov.vn,.2005.
2. Lê Huy Chính (2003), Vi sinh y học. Nxb Y học, Hà Nội.
3. Phan Văn Hải và cs (2005). "Đánh giá tình hình vệ sinh an toàn thức ăn đường phố tại Thị xã Kon Tum." Cục An toàn vệ sinh thực phẩm - www.vfa.gov.vn
4. Nguyễn Thị Hiền, Phạm Thanh Yến, Phan Thị Kim, Nguyễn Thị Sợt, Nguyễn Thị Khánh Sâm (2005), Tình hình ô nhiễm vi khuẩn và nhận thức vệ sinh an toàn thực phẩm ở người kinh doanh thức ăn đường phố. Cục An toàn vệ sinh thực phẩm, <http://www.vfa.gov.vn>.
5. Lâm Quốc Hùng (2009), Phòng chống ngộ độc tại Việt Nam năm 2008, dự báo và giải pháp phòng chống ngộ độc thực phẩm năm 2009, Cục an toàn vệ sinh thực phẩm, http://vfa.gov.vn/news.asp?ID=21322.
6. Nguyễn Lý Hương, Nguyễn Thị Phấn và Bùi Thị Kim Dung (2005), Khảo sát tình hình ô nhiễm vi sinh vật trên một số mặt hàng thực phẩm ăn liền bán tại các chợ ở tp.Hồ Chí Minh trong 3 năm 2002-2004, Trung tâm y tế dự phòng tp.Hồ Chí Minh, Thông tin khoa học, Cục An toàn vệ sinh thực phẩm, 2005. <http:// www.vfa.gov.vn/Default.aspx>.
7. Nghiêm Ngọc Minh, Hầu Thị Thu Trang, Nguyễn Thị Hoài Thu (2011), Biểu hiện và tinh sạch protein nội độc tố Staphylococcal enterotoxin B (SEB) trong các chủng Staphylococcus aureus phân lập từ các vụ ngộ độc thực phẩm, Tạp chí khoa học và công nghệ 86 (10): p. 179-183.
8. Nguyễn Đỗ Phúc, Hoàng Hoài Phương và Bùi Kiều Nương (2003), Đánh giá mức độ ô nhiễm vi sinh vật thức ăn đường phố tại thành phố Hồ Chí Minh năm 2002, Viện Vệ Sinh Y tế Công Cộng Tp HCM, Thông tin khoa học, Cục An toàn vệ sinh thực phẩm, (2003) <http// www.vfa.gov.vn/Default.aspx>.
9. Đông Phương (2008). "Đề phòng ngộ độc thực phẩm do tụ cầu vàng. "http://news.restaurants.com.vn/?page=tintuc&code=home&id=587
10..Trần Thị Thành (2005), Tình hình ngộ độc thực phẩm tại Tiền Giang năm 2000-2004. Cục An toàn vệ sinh thực phẩm.
11. Trần Văn Thọ và cs, 2004. Đánh giá thực trạng và đề xuất một số giải pháp quản lý chủ yếu bảo đảm vệ sinh an toàn thực phẩm ở Hải Phòng. Cục An toàn vệ sinh thực phẩm, <www.vfa.gov.vn>.
Tài liệu Tiếng Anh
12. Baba T., Bae T., Schneewind O., Takeuchi F., Hiramatsu K. (2008), Genome sequence of Staphylococcus aureus strain Newman and comparative analysis of staphylococcal genomes: polymorphism and evolution of two major pathogenicity islands, J. Bacteriol, 190(1), 300-310
13.Bradford, 1976, Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding,Anal Biochem,72 : 248–254.
14. Bruce A. G., Kermit D. H. (2009), CBRNE - Staphylococcal enterotoxin B,http://emedicine.medscape.com/article/830715-overview.
15. CAST (1994), CAST Report: Foodborne Pathogens: Risks and Consequences, Task Force Report No. 122, Washington, DC: Council for
R. J. (1993),Staphylococcalfood poisoning in the United Kingdom, 1969-
90, Epidemiol. Infect,110:519-531
16. Chen J. Y., Qiao Y., Komisar J. L., Baze W. B., Hsu I. C., Tseng J. (1994), Increased susceptibility to staphylococcal enterotoxin B intoxication in mice primed with actinomycin D, Infect. Immun, 62 (10), 4626-4631.
17. Christopher L. J., Saleem A. K.(1986), Nucleotide Sequence of the Enterotoxin B Gene from Staphylococcus aureus,Journal of bacteriology, 166(1),29-33.
18. Gill S. R., Fouts D. E., Archer G. L., Mongodin E. F., Deboy R. T., Ravel J., Paulsen I. T., Kolonay, J. F., Brinkac L., Beanan M., Dodson R. J., Daugherty S. C., Madupu R., Angiuoli S. V., Durkin A. S., Haft D. H., Vamathevan J., Khour I. H., Utterback T., Lee C., Dimitrov G., Jiang L., Qin H., Weidman J., Tran K., Kang K., Hance I. R., Nelson K. E., Fraser C. M. (2005), Insights on evolution of virulence and resistance from the complete genome analysis of an early methicillin-resistant Staphylococcus
aureus strain and a biofilm-producing methicillin-resistant Staphylococcus
epidermidis strain, J. Bacteriol, 187, 2426-2438.
19. Haeghebaert S., Le Q. F., Gallay A., Bouvet P., Gomez M., Vaillant V.(2002), Les toxi-infections alimentaires collectives en France, en 1999 et 2000,Bull. Epidémiol. Hebdo, 23, 105-109.
20. Herron O. L., Fitzgerald J. R., Musser J. M., Kapur V. (2007), Molecular correlates of host specialization in Staphylococcus aureus, PLoS ONE,
2(10), E1120; Holden M. T.,Feil E. J., Lindsay J. A., Peacock S. J., Day
N. P., Enright M. C., Foster T. J., Moore C. E., Hurst L., Atkin R.,Barron A., Bason N., Bentley S. D., Chilling W. C., Chilling W.T., Churcher C., Clark L., Corton C., Cronin A.,Doggett J., Dowd L., Feltwell T., Hance
Z., Harris B., Hauser H.,Holroyd S., Jagels K., James K. D., Lennard N., Line A., Mayes R.,Moule S., Mungall K., Ormond D., Quail M. A., Rabbinowitsch E., Rutherford K., Sanders M., Sharp S., Simmonds M., Stevens K.,Whitehead S., Barrell B. G., Spratt B. G., Parkhill J. (2004), Complete genomes of two clinical Staphylococcus aureus strains: evidence for the rapid evolution of virulence and drug resistance, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101(26), 9786-9791.
21. Huang L. Y., Bergdoll M. S. (1970), The primer structure of staphylococcal enterotoxin B, J. Biol. Chem, 245, 3518-3525.
22. Korolev S., Pinelis D., Savransky V., Komisar J., Vogel P., Fegeding K. (2003), Toxicity of the staphylococcal enterotoxin B mutants with histidine-to-tyrosine substitutions, Toxicology,187(2/3), 229–238.
23. Lee J. S., Dyas B. K., Nystrom S. S., Lind C. M., Smith J. F., Ulrich R. G. (2002), Immune protection against staphylococcal enterotoxin-induced toxic shock by vaccination with Venezuelan equine encephalitis virus replicon, J. Infect. Dis, 185, 1192-1196.
24. Lowell G. H., Colleton C., Frost D., Kaminski R. W., Hughes M., Hatch J., Hooper C., Estep J., Pitt L., Topper M., Hunt R. E., Baker W., Baze W. B. (1996), Immunogennicity and efficacy agains lethal aerosol staphylococcal enterotoxin B challenge in monkeys by intramuscular and respiratory delivery of proteosome – toxoid vaccines, Infect. Immun,
64(11), 4686-4693.
25. Mary K, Sandel, John L, McKillip. 2002. Virulence and recovery of
Staphylococcus aureus to the food industry using improvement on
traditional approaches. Food control 15:5-10.
26. Nema V., Agrawal R., Kamboj D. V., Goel A. K., Singh L. (2007), Isolation and characterization of heat resistant enterotoxigenic
Staphylococcus aureus from a food poisoning outbreak in Indian subcontinent, Int. J. Food Microbiol, 117(1), 29-35.
27. Ono H. K., Omoe K., Imanishi K., Iwakabe Y., Hu D. L., Kato H. (2008), Identification and characterization of two novel staphylococcal enterotoxins, types S and T, Infect Immun, 76(11), 4999-5005.
28. Rose W. C., Bradley S. G. (1971), Enhanced toxicity for mice of combinations of antibiotics with Escherichia coli cells or Salmonella typhosa endotoxin, Infect. Immun, 4(5), 550-555.
29. Sambrook J and R. DW., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3nd ed. Cold Spring Harbor Press: New York, 2001.
30. SavranskyV., Pinelis D., Korolev S., Ionin B., Fegeding K. (2004), Immunogenicity of the histidine-to-tyrosine staphylococcal enterotoxin B mutant protein in C3H/HeJ mice, Toxicon, 43, 433–438.
31. Schlech WF, Lavigne PM, Bortolussi RA, Allen AC, Haldane EV, Wort AJ, Hightower AW, Johnson SE, King SH, Nicholls ES and others. 1983. Epidemic listeriosis--evidence for transmission by food.