Phương pháp Bradford cho kết quả rất nhanh, chính xác và các mẫu có thể được kiểm tra lại trong vòng vài phút. Phương pháp này được khuyến khích sử dụng để xác định hàm lượng protein. Khảo nghiệm Bradford khá nhạy cảm với albumin huyết thanh bò, nhiều hơn so với protein khác. IgG (Immunoglogin gamma globulin) là protein tiêu chuẩn.
Trong dung dịch mang tính axit khi chưa kết nối với protein SEB thì thuốc nhuộm ở dạng màu đỏ có bước sóng hấp thụ cực đại là 465 nm và khi kết hợp với protein SEB thì thuốc nhuộm chuyển sang màu xanh dương và hấp thụ cực đại ở bước sóng 595 nm. Độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm có liên hệ một cách trực tiếp với nồng độ protein. Để xác định protein trong mẫu, đầu tiên ta xây dựng một đường chuẩn với dung dịch protein chuẩn đã biết nồng độ. Lượng protein trong mẫu dung dịch đo được xác định bằng cách dựa vào đường chuẩn từ đó suy ra giá trị nồng độ protein tương ứng trên trục hoành.
Đầu tiên, chúng tôi đã tiến hành dựng đồ thị chuẩn BSA với thang chuẩn từ 0 - 100 µg. Kết quả đo độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm cho kết quả trong bảng 3.1. Từ kết quả đo độ hấp phụ chúng tôi đã xây dựng đường chuẩn và thiết lập được phương trình hồi quy tuyến tính: Y = 0.185X. (hình 3.6).
Từ các kết quả đo độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm của các phân đoạn protein SEB và phương trình hồi quy tuyến tính vừa xây dựng, nồng độ protein SEB trong các phân đoạn tinh sạch bằng cột Ni - NTA đã được xác định trong bảng 3.2.
Bảng 3.1. Kết quả đo độ hấp thụ BSA ở bước sóng 595 nm STT BSA (mg/ml) Elution Buffer (µl) BSA (µl) OD595nm 1 0 100 0 0 2 0,125 87,5 12,5 0,003 3 0,25 75 25 0,045 4 0,5 50 50 0,094 5 0,75 25 75 0,136 6 1 0 100 0,187
Hình 3.6. Đồ thị đường chuẩn định lượng protein bằng BSA có phương trình
Bảng 3.2. Nồng độ protein SEB sau tinh sạch
Kết quả định lượng protein SEB cho thấy, sản phẩm đã được tinh sạch, có nồng độ tương đối đồng đều ở các phân đoạn. Protein thu được ở các phân đoạn sau khi tinh sạch sẽ được trộn lẫn và đo OD595nm để xác định nồng protein trung bình ở dạng đột biến để phục vụ cho nghiên cứu tiếp theo. Kết quả nồng độ protein SEB là 1,278 mg/ml.