1.3.1. Đặc điểm cấu trúc
SEB là một trong các nội độc tố được sinh ra bởi vi khuẩn S. aureus. Thông thường khi bị lây nhiễm vào cơ thể, SEB sẽ tác động chủ yếu lên các hệ thống vận chuyển ion và nước của ruột, do đó được gọi là enterotoxin (độc tố ruột. Độc tố ruột SEB bền với nhiệt là tác nhân chính thường gặp nhất trong các vụ ngộ độc thực phẩm do S. aureus [14].
Độc tố ruột được hình thành khi tụ cầu vàng sống trong điều kiện khắc nghiệt như nhiệt độ môi trường gia tăng đột ngột, thiếu oxy, sư mất cân bằng trong áp suất thẩm thấu .v.v [5].
Đóng vai trò là một trong những nội độc tố quyết định của vi khuẩn S.
aureus nên SEB được nghiên cứu khá chi tiết. Trình tự acid amin của SEB đã
được xác định từ năm 1970 [21].
Giống như các cấu trúc protein ngoại bào khác của S. aureus thường được tìm thấy trong môi trường nuôi cấy hay trong thực phẩm bị ô nhiễm, protein SEB bao gồm một trình tự tín hiệu (signal peptide) gồm 27 acid amin ở đầu N‟. Đoạn trình tự tín hiệu này có chức năng “dẫn” SEB tiết ra ngoài môi trường nuôi cấy, sau đó trình tự này sẽ bị cắt bởi protease ở vị trí nhất định. SEB dạng hoạt động trong môi trường ngoài tế bào gồm 239 acid amin trong một chuỗi polypeptit đơn, có khối lượng phân tử khoảng 28,336 kDa. Ở dạng hoạt động protein SEB có cấu trúc gồm: 7 cấu trúc xoắc α, 14 phiến gấp nếp β và một cầu nối disulphit nối cystein ở vị trí 120 và 140 [48]. Theo Gleason và cs (2009), protein SEB có 2 vùng cấu trúc đặc biệt phức tạp được đóng gói nhỏ gọn chặt chẽ nên cho phép SEB chống lại sự tác động của các protease gồm trysin, chymotrypsin và papain có trong ruột [14].
Staphylococcal enterotoxin B có cấu trúc và đặc tính sinh học gần giống với các độc tố ruột khác là A, C, D, E, F, G, S, T cùng do vi khuẩn S. aureus tạo ra. Đặc biệt, trình tự acid amin của SEB có mối tương đồng cao với trình tự acid amin độc tố ruột C1 cũng có 239 acid amin [17]. SEB chỉ thiếu các vị trí bám của kẽm so với các siêu kháng nguyên staphylococcal enterotoxin A, C2 và D chỉ có một vị trí bám trên phân tử MHC nhóm II. Phân tích vị trí bám trên TCR của các kháng nguyên SEA, SEB và SEC2 sẽ chỉ ra sự khác biệt dẫn tới hiệu quả bám lên vùng Vβ [14].
Năm 1986, Christopher và cs đã xác định thành công trình tự gen seb của chủng vi khuẩn S. aureus S6. Theo đó, trình tự của 1 gen seb hoàn thiện được tính từ codon mở đầu ATG ở vị trí nucleotide 244, sau đó là khung đọc mở gồm 798 nucleotide, và kết thúc tại codon TGA tại vị trí nucleotide thứ 1042 [17]. Đoạn gen seb phân lập từ các chủng được phân lập từ nhiều vùng địa lý khác nhau đã được nhiều tác giả trên thế giới nghiên cứu chi tiết. Trình tự gen
seb của các chủng khác nhau như PM36 (AB479118, ATCC14458, AY518386), COL (CP000046, AF410775) .v.v được công bố trên ngân hàng dữ liệu gen (NCBI) [18, 26, 40]. Cấu trúc tinh thể của protein SEB (hình 1.3) được xác định ở độ phân giải 1,5A là độ phân giải cao nhất cho đến nay dành cho 1 siêu kháng nguyên.
1.3.2. Cơ chế gây bệnh
Staphyloccoccal enterotoxin B (SEB) là trung gian kích thích các lympho T ở hệ miễn dịch của các vật chủ. Các độc tố liên kết trực tiếp đến phức hợp protein (MHC) lớp II trên bề mặt tế bào đích, sau đó kích thích gia tăng số lượng lớn các lympho T.
SEB được coi là một “siêu kháng nguyên” của vi khuẩn vì có thể tạo thành một “cầu nối” giữa MHC lớp II của các tế bào trình diện kháng nguyên và vùng Vβ của các thụ thể tế bào T như CD4, CD8; từ đó, kích thích hoạt hóa các tế bào T biểu hiện các đoạn gen Vβ mà không cần thiết phải có quá trình thực bào và trình diện kháng thông thường.
Siêu kháng nguyên bám trực tiếp vào phức hợp MHC lớp II của tế bào trình diện kháng nguyên bên ngoài vị trí bám thông thường của kháng nguyên; 1/5 các tế bào T trong cơ thể bị kích thích sản xuất cytokin một cách ồ ạt gây nên hiện tượng shock độc tính trong cơ thể (hình 1.4). Điều này sản sinh ra một số lượng lớn của cytokine, interleukin 2 (IL-2), các yếu tố hoại tử khối u β (TNF-β), và các interferon. Nếu ăn thực phẩm có SEB bệnh nhân có các triệu chứng như chán ăn, buồn nôn, nôn và tiêu chảy. Các triệu chứng này xuất hiện là do các cytokine trong các tế bào T của lông ruột được sinh ra một cách ồ ạt .
SEB dễ dàng hòa tan trong nước, tính chất hóa học tương đối ổn định. SEB có khả năng chịu tác động cơ học ở mức vừa phải và có thể chịu được nhiệt độ sôi trong vòng 10 phút. Nếu được bảo quản trong môi trường đông lạnh khô, SEB có thể được lưu trữ trong hơn một năm [14].
Hình 1.4. Siêu kháng nguyên và miễn dịch không thụ động của tế bào T [51]
1.3.3. Staphylococcal enterotoxin B tái tổ hợp và tiềm năng ứng dụng
Công nghệ sinh học hiện đại có khả năng tạo ra các protein tái tổ hợp ứng dụng trong nhiều lĩnh vực trong đó có y sinh học, chống khủng bố sinh học và chiến tranh sinh học. Biểu hiện gen seb thành protein tái tổ hợp không độc phục vụ nghiên cứu tạo vaccine an toàn nhằm ngăn ngừa ngộ độc thực phẩm do SEB gây nên. Năm 2002, Lee và cs đã nghiên cứu tạo vaccine tiềm năng phòng chống SEB dựa trên việc sử dụng hệ vector từ virus mang gen mã hóa SEB đột biến. Chuột sau khi tiêm vaccine này có khả năng chống lại được 5 liều trung bình SEB [23]. Tiếp đó, Woody và cs (1997) đã nghiên cứu tạo được 2 loại protein SEB mang đột biến thay thế asparagine bằng lysine tại
vị trí 23 (N23K) và phenylalanine bằng serine tại vị trí 44 (F44S) trên trình tự polypeptid SEB không độc. Theo đó, khi thử nghiệm 10 µg SEB N23K và F44S (tương đương liều 30 LD50) đã không gây chết chuột thử nghiệm. Một điều thú vị là mặc dù protein SEB N23K và F44S thử nghiệm ở liều lượng thấp nhưng vẫn được phát hiện bởi phương pháp miễn dịch liên kết enzym ELISA nhờ kháng thể đa dòng kháng SEB. Sử dụng SEB tái tổ hợp N23K, F44S sẽ thúc đây phản ứng kháng SEB bảo vệ 80 - 87% chuột [39]. Ngoài ra, Lowell và cs cũng nghiên cứu thấy SEB qua xử lý với formalin sẽ trở nên mất độc và được gọi là giải độc tố B của tụ khuẩn. Khi chuột dùng qua đường mũi vaccine proteosome SEB giải độc tố sẽ tạo ra được mức cao kháng thể IgG kháng lại SEB trong máu và kháng thể IgA kháng lại SEB ở niêm mạc đường hô hấp và ruột. Vaccine proteosome SEB giải độc tố này cũng đã chứng tỏ hiệu quả bảo vệ tối ưu với 100% số khỉ thực nghiệm [24].
Năm 1992, Swaminathan và cs đã nhận thấy những thay đổi nhỏ trên bề mặt phân tử SEB tại vị trí hoạt động rãnh 4α tạo ra các SEB không độc trong khi vẫn bảo thủ khả năng miễn dịch của phân tử [34]. Năm 1994, Thibodeau đã phân tích cấu trúc tinh thể SEB đột biến và tìm ra vị trí hoạt động gây nên triệu chứng nôn mửa gồm 14 acid amin nằm trong vùng từ acid amin 113 - 126 (rãnh α4). 14 acid amin nối vùng 1 và 2 của phân tử SEB và trong 14 acid amin có 11 acid amin là giống nhau với mọi SEs. Tại rãnh α4 có từ 3 tới 5 vị trí có histidine (H32, h121 và h166) rất quan trọng cho các tế bào T (TCR - T Cell Receptor) bám vào [35]. Năm 1982, Stelma và Bergdoll đã khá thành công trong nghiên cứu làm giảm độc tính của SEA và SEB bằng cách methyl hóa nhóm carboxyl ở các phân tử histidine trong cấu trúc protein SEB. Các phân tử SEA, SEB khi được methyl hóa nhóm carboxyl của các histidine không những có thể làm giảm độc tính của các kháng nguyên mà còn bảo tồn được khả năng gây miễn dịch của chúng [32]. Vì tyrosine có cấu trúc gần giống với histidine nên thay thế histidine tích điện dương bằng tyrosine ưa
nước sẽ không làm thay đổi cấu trúc bề mặt phân tử, do đó có thể thay thế việc methyl hóa nhóm carbonxyl của histidine ở thí nghiệm trên. Dựa trên cơ sở đó, năm 2003, Korolev và cs đã nghiên cứu tạo 4 đột biến điểm thay thế các acid amin histidine bởi các tyrosine tại 4 vị trí có codon mã hóa cho histidine (codon 12; 32; 105 và 121) [22]. Tác giả Savransky và cs sau đó 1 năm (2004) cũng khẳng định SEB mang 4 đột biến thay thế histidine bằng tyrosine tại vị trí các codon 12; 32; 105; 121 đã tạo ra một kháng nguyên tái tổ hợp không mang độc tố, và có khả năng kích ứng ở mức độ cao các kháng thể IgG đặc hiệu [30].
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu, trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu 2.1.1. Đối tƣợng thí nghiệm 2.1.1. Đối tƣợng thí nghiệm
- Động vật thí nghiệm gồm 60 chuột nhắt cái trắng khỏe mạnh, không dị tật, có trọng lượng từ 20 ± 2 g/con, khoảng 6 - 8 tuần tuổi được nuôi 3 ngày ổn định trước thử nghiệm tại phòng nuôi động vật của Bộ môn Miễn dịch học, Học viện Quân Y để sử dụng cho việc kiểm tra độc tính của protein SEB đột biến.
- Chuột Balb/C thuần chủng từ 4 - 6 tuần tuổi, trọng lượng trung bình là 8 - 20 g sử dụng cho thí nghiệm gây đáp ứng miễn dịch.
2.1.2. Chủng vi khuẩn và plasmid
- Protein tái tổ hợp SEB dạng tự nhiên đã tinh sạch do phòng Công nghệ sinh học môi trường - Viện Công nghệ sinh học cung cấp.
- Vector pET21a+ mang gen seb đột biến được bảo quản trong tủ ở nhiệt độ -80o
C; tế bào vi khuẩn Escherichia coli BL21(DE3) được sử dụng cho mục đích biểu hiện protein SEB do Phòng Công nghệ sinh học môi trường - Viện Công nghệ sinh học cung cấp.
2.1.3. Các bộ kit
- Kít tách chiết Plasmid (GeneJettmPlasmid Miniprep kit, Fermentas). - Kít tinh sạch protein (Purification Protocols của hãng Invitrogen).
2.1.4. Hóa chất, máy móc và thiết bị
Các hóa chất chính được sử dụng: Bacto pepton, yeast extract, NaCl,
agarose, glucose, trypton, KCl, Tris HCl, EDTA, NaOH, MgSO4, MgCl2, glycerol, CaCl2, BSA, ethanol 70%, Reagent Bradford, các dung dịch đệm muối phosphate, nước khử ion. Kháng sinh ampicillin và các loại hóa chất thông dụng khác (ethidium bromide,.v.v.), thang chuẩn DNA, protein
(Fermentas (Mỹ)), các loại enzym cắt giới hạn (EcoRI, HindIII), Taq DNA polymerase được mua từ các hãng Fermentas, Invitrogen, Merck, Sigma, do Phòng Công nghệ sinh học môi trường - Viện Công nghệ Sinh học cung cấp.
Hóa chất sử dụng cho phản ứng Western blot: màng PVDF, Tris-HCl,
Glycine, Methanol, Dung dịch Ponceau, Cộng hợp kháng IgG chuột gắn Horseradish peroxidase (HRP), cơ chất 4-chloro-1-naphtol.
Thiết bị sử dụng: Bộ điện di DNA (Labnet), hệ thống máy chạy Western
blot của Biorad, lò vi sóng (Sanyo (Nhật Bản)), máy soi DNA (Mini- transllumminatior, Bio-Rad, Mỹ), máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thụy Điển), máy Vortex (Mimishaker, IKA, CHLB Đức), máy hút chân không Speed-Vac 110A (Savant, Mỹ), máy ly tâm, máy xung điện Gen Pulser, cùng với các trang thiết bị khác của Phòng Công nghệ sinh học môi trường và Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen quốc gia, Viện Công nghệ sinh học.
2.1.5. Môi trƣờng và đệm
Môi trường cho vi khuẩn và các loại đệm sử dụng trong nghiên cứu được chuẩn bị theo Sambrook và cs (2001) [29] hoặc theo sự hướng dẫn của nhà sản xuất.
2.1.6. Phần mềm
Xử lý số liệu bằng Exel, Gel Doc - IT System (hệ thống ghi hình ảnh và phân tích gel sau điện di protein).
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu 2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu
Hình 2.1. Sơ đồ các bước nghiên cứu
2.2.2. Các phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.2.1. Phƣơng pháp biến nạp vào tế bào khả biến Escherichia coli
BL21(DE3)
Nguyên lý:
Biến nạp là quá trình chuyển DNA trực tiếp vào tế bào nhận, những tế bào có khả năng tiếp nhận DNA được gọi là tế bào khả biến. Quá trình này gồm 2 giai đoạn: tạo tế bào khả biến và biến nạp.
Tiến hành:
- Bổ sung 2,5 µl DNA plasmid vào 100µl BL21, trộn hỗn hợp trên trong eppendorf (epp) 2ml.
- Đặt ổn định hỗn hợp trong đá 15 phút.
- Sốc nhiệt ở 42oC trong vòng 90 giây sau đó để trong đá 15 phút.
- Bổ sung 300 µl môi trường LB lỏng, nuôi lắc với tốc độ 220 v/p trong vòng 60 phút nhiệt độ 37oC ở thiết bị nuôi lắc ổn định.
- Cấy trải 50 - 150 µl mẫu trên môi trường thạch LB chứa kháng sinh ampicillin 100 mg/l (tỉ lệ kháng sinh với LB là 1:1000).
- Nuôi cấy trong tủ ấm 37oC, qua đêm.
2.2.2.2. Phƣơng pháp tách DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn E. coli
BL21(DE3)
Nguyên lý:
Phương pháp tách chiết DNA plasmid dựa trên nguyên lý sử dụng các hóa chất (SDS, NaOH) có tác dụng phá vỡ cấu trúc thành tế bào vi khuẩn và gây biến tính các phân tử protein. Khi thay đổi pH của dịch chiết tế bào bằng dung dịch có chứa kali acetat, các phân tử protein và DNA hệ gen sẽ bị kết tủa, tách ra khỏi dung dịch bằng li tâm tốc độ cao. DNA plasmid được tủa lại bằng ethanol 100% hoặc isopropanol. Lượng RNA còn tồn tại trong dung dịch chứa DNA plasmid được loại bỏ bằng cách bổ sung Rnase.
Tiến hành:
- Nuôi lỏng khuẩn lạc trong 3 ml môi trường LB lỏng có bổ sung 3 µl amppicillin, nuôi lắc qua đêm (khoảng 12 - 16 giờ).
- Lấy 1400 µl dịch khuẩn đã nuôi qua đêm đó cho vào eppendorf 2ml, ly tâm 8000 v/p trong 2 phút ở 25oC. Thu lấy cặn vi khuẩn ở đáy ống. Lặp lại bước trên 1 lần nữa.
Dùng kit tách plasmid của hãng fermentas:
- Bổ sung: 250 µl Lysis solution đảo đều tay (invert).
- Bổ sung: 350 µl Neutralization solution, đảo đều tay (invert). - Ly tâm 12000 v/p trong 5 phút ở 25oC
- Chuyển sang cột spin column: chỉ hút pha trên (không hút dịch trắng). - Ly tâm 12000 v/p trong 1 phút, loại hết dịch phía dưới cột
- Bổ sung: 500 µl Wash Solution vào cột, ly tâm 12000 v/p trong 1 phút, sau đó loại dịch phần dưới.
- Lặp lại bước trên 1 lần nữa.
- Sau đó ly tâm 1 lần nữa để loại hết Wash Solution.
- Chuyển sang eppendorf 2 ml sạch. Bổ sung 50 µl Elution Buffer vào trung tâm cột, không được chạm vào màng.
- Để ở nhiệt độ phòng trong 2 phút, sau đó ly tâm 12000 v/p trong 2 phút, bỏ cột, ghi nhãn cho sản phẩm.
- Kết quả được điện di trên gel agarose.
- Bảo quản sản phẩm trong tủ ở nhiệt độ -20oC để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
2.2.2.3 Phƣơng pháp xử lý enzym hạn chế
Nguyên lý:
Enzym hạn chế là các nuclease nội bào (endonuclease) có khả năng nhận biết và cắt các đoạn DNA tại các vị trí với trình tự nucleotide nhất định. Trong nghiên cứu này hai enzym hạn chế EcoRI và HindIII được sử dụng với mục đích để kiểm tra vector tái tổ hợp pET21a+ mang gen seb tách chiết từ các dòng tế bào vi khuẩn E. coli chủng BL21(DE3) sau khi được chuyển vector này. Về nguyên tắc thành phần phản ứng cắt enzym hạn chế không khác nhau, điểm khác nhau chỉ có là thể tích của các thành phần sẽ được điều chỉnh thích hợp với mỗi mục đích và DNA mẫu.
Phản ứng cắt kiểm tra vector tái tổ hợp pET21a+ mang gen seb tách chiết từ các dòng tế bào vi khuẩn E. coli chủng BL21(DE3) thực hiện với các thành phần như sau:
Thành phần phản ứng Thể tích (µl)
Nước khử ion vô trùng Đệm R (10X)
Enzym EcoRI (10u/µl) Enzym HindIII (10u/µl) Vector pET 21a+/SEB
2 1 1 1 5 Tổng thể tích 10
Thành phần phản ứng được trộn đều và tiến hành trong 2 giờ ở nhiệt độ 37oC, sản phẩm phản ứng được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%.
2.2.2.4. Biểu hiện protein Staphyloccoccal enterotoxin B trong tế bào vi khuẩn Escherichia coli chủng BL21(DE3)