3.1.1. Biến nạp 21a+ mang gen seb vào chủng E. coli
BL21(DE3)
E. coli BL21(DE3) là chủng vi khuẩn biểu hiện gen thường được sử
dụng khi biểu hiện một protein lạ và là vật chủ phù hợp cho biểu hiện protein khi dùng vector biểu hiện có chứa promoter T7 hoặc lac promoter T7 như vector pET21a+. Hơn nữa chủng vi khuẩn E.coli BL21(DE3) đã được biến đổi để tăng cường khả năng biểu hiện protein ngoại lai. Bởi vậy, đây là chủng phù hợp với đối tượng và mục đích nghiên cứu của đề tài.
Vector tái tổ hợp pET21a+ mang gen seb được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli chủng BL21(DE3) bằng phương pháp sốc nhiệt. Dịch khuẩn được nuôi cấy trải trên môi trường chọn lọc có bổ sung kháng sinh ampicilline 100 mg/l. Sau 14 giờ nuôi cấy ở 37ºC, các khuẩn lạc màu trắng đã xuất hiện trên bề mặt đĩa thạch (hình 3.1)
Hình 3.1.Khuẩn lạc E. coli BL21mang plasmid tái tổ hợp
Để kiểm tra sự có mặt của plasmid tái tổ hợp trong các dòng khuẩn lạc cấy trải, chúng tôi tiến hành tách DNA plasmid theo kit của Fermentas. Sản phẩm được điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra và kết quả được thể hiện trên hình 3.2:
Kết quả thu được trên hình 3.2 cho thấy: ở giếng đối chứng (+) cho 1 băng có kích thước khoảng 5400 bp đúng với kích thước của pET21a+, ở tất cả các giếng kiểm tra (1, 2, 3, 4) đều xuất hiện một băng với kích thước khoảng 6200 bp tương ứng với kích thước của gen seb với kích thước 800 bp và vector pET21a+ với kích thước 5443 bp. Theo lí thuyết điện di, phân tử DNA có kích thước càng lớn sẽ di chuyển càng chậm trong bản gel, do đó, khoảng cách di chuyển của các phân tử có kích thước lớn ngắn hơn các phân
Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm tách DNA plasmid
M: thang DNA chuẩn 1 kb
+: vector pET21a+
1, 2, 3, 4: Sản phẩm tách plasmid của các dòng khuẩn lạc BL21(DE3)
tử có kích thước nhỏ [29]. Điều này cho thấy đoạn gen đích đã được gắn vào vector tách dòng pET21a+.
Để kết quả chắc chắn hơn, chúng tôi đã tách và kiểm tra plasmid của khuẩn lạc các dòng số 1, 2, 3, 4. Các plasmid sau khi tách được xử lý bằng 2 enzym cắt giới hạn EcoRI và HindIII. Theo tính toán lý thuyết, sản phẩm cắt vector tái tổ hợp seb/pET21a+ phải có 2 băng ở hai vị trí tương ứng kích thước của gen seb (khoảng 800bp) và kích thước của vector pET21a+ (khoảng 5400 bp). Kết quả xử lý DNA plasmid các dòng bằng enzym đã được kiểm tra trên gel 1% (hình 3.3).
Hình 3.3. Điện di đồ DNA plasmid tái tổ hợp
cắt bằng enzym EcoRI , HindIII
M: Marker 1Kb.
Giếng số 1 - 4: Sản phẩm cắt DNA plasmid dòng khuẩn lạc BL21(DE3) mang vector tái tổ hợp
Kết quả trên hình 3.3 cho thấy: ở các giếng 1, 2, 3, 4, sản phẩm cắt phân thành 2 băng tương ứng với kích thước của vector pET21a+ khoảng 5400 bp và kích thước của đoạn gen seb khoảng 800 bp phù hợp với tính toán lý thuyết.
Từ đó chúng tôi có thể nhận định đoạn gen seb đã được gắn vào vector pET21a+.
Kết quả đo nồng độ và độ tinh sạch của các mẫu plasmid cho thấy các dòng tế bào tăng sinh khá tốt và quá trình tinh sạch là đảm bảo chất lượng. Các tác giả khác khi sử dụng các bộ kít tinh sạch của các hãng như Fermentas, Promega... đều cho kết quả tương tự.
Bốn plasmid này có nồng độ tương đối đồng đều và đủ độ tinh sạch. Chứng tỏ quá trình tách plasmid được thực hiện tốt.
Kết quả tách chiết DNA plasmid của chúng tôi đã khẳng định đoạn gen
seb đã được nhân lên với số lượng lớn trong tế bào vi khuẩn E. coli
BL21(DE3).
Do vậy, các mẫu DNA plasmid thu được đủ điều kiện về độ tinh sạch và nồng độ phục vụ cho quá trình biểu hiện gen tạo protein tái tổ hợp.
3.1.2. Nghiên cứu biểu hiện gen seb với các điều kiện tối ƣu
Gen seb trong vector biểu hiện hoạt động dưới sự điều khiển của T7 lac promoter và được kiểm soát chặt chẽ bởi chất cảm ứng IPTG (isopropyl-β-D- thiogalactoside) có trong môi trường. Do đó, để nghiên cứu sự biểu hiện của protein tái tổ hợp, vi khuẩn sau khi biến nạp thành công được nuôi cấy trong môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh ampicillin và chất cảm ứng IPTG.
Trước khi thực hiện cảm ứng biểu hiện bằng IPTG, các tế bào vi khuẩn
nuôi lắc ở nhiệt độ 37oC trong môi trường LB chứa kháng sinh ampicillin 100mg/l cho đến khi các tế bào bước vào pha luỹ thừa (OD600 nằm trong khoảng 0,6 đến 0,8). Chúng tôi đã tiến hành biểu hiện protein tái tổ hợp SEB ở nồng độ IPTG 0,1 mM, nhiệt độ 30o
C và thời gian cảm ứng là 5 giờ dựa theo công bố của tác giả Nghiêm Ngọc Minh và cs năm 2011 [7].
Sau 5 giờ cảm ứng, tiến hành ly tâm 4000 vòng trong 15 phút để thu sinh khối tế bào. Sau đó, chúng tôi bổ sung Native Binding Buffer rồi phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm và tiến hành ly tâm 13000 vòng trong 15 phút để tách riêng pha cặn và pha dịch. Kiểm tra trên gel polyacrylamide thấy protein SEB biểu hiện ở dạng hòa tan đủ lượng thì tiến hành tinh sạch.
Kết quả kiểm tra protein tổng số của các dòng tế bào mang plasmid seb/pET21a+/BL21 tái tổ hợp và dòng đối chứng được trình bày ở hình 3.4.
Hình 3.4. Điện di đồ protein SEB dạng tan trước khi tinh sạch.
M: Thang protein chuẩn;
1. Protein tổng số mẫu đối chứng (-) không cảm ứng IPTG
2. Protein tổng số trong pha dịch
Từ kết quả trên hình 3.4 cho thấy, ở giếng 2 là protein dạng tan trong pha dịch của vi khuẩn BL21(DE3) mang vector biểu hiện SEB/pET21a+ có cảm ứng IPTG xuất hiện 1 băng protein có trọng lượng khoảng 28 kDa tương ứng với trọng lượng protein SEB theo đúng tính toán lí thuyết. Kết quả này được giải thích là khi có mặt chất cảm ứng IPTG thì lac repressor thay đổi cấu hình và không thể gắn vào lac operator. Sự loại bỏ lac repressor ra khỏi operator cho phép RNA polymerase bám vào lac promoter và khởi động quá trình phiên mã. Protein tổng số mẫu đối chứng (-) do không cảm ứng IPTG nên không biểu hiện được protein có kích thước mong muốn.
Với 1 băng vạch đậm và đúng kích thước tính toán trên điện di đồ ở giếng cho protein tổng số trong pha dịch (hình 3.4 giếng 2), ta có thể kết luận đã biểu hiện thành công protein SEB trong chủng biểu hiện BL21(DE3) với các điều kiện tối ưu là 30o
C; IPTG 0,1 mM; 5 giờ cảm ứng.
Để có được protein đích phục vụ cho việc kiểm tra độc tính của protein SEB và gây đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể đặc hiệu chúng tôi tiếp tục tiến hành tinh sạch protein SEB thu được từ dịch chiết thô sau quá trình biểu hiện.
3.2. Tinh sạch protein tái tổ hợp Staphylococcal enterotoxin B
Theo thiết kế vector biểu hiện seb/pET21a+, khi protein SEB được tổng hợp, nó sẽ nối thêm 6 acid amin Histidine ở đầu (-COOH). Đây là một đặc điểm thuận lợi cho việc tinh sạch sản phẩm, đồng thời cũng là một tín hiệu để nhận biết sản phẩm được tổng hợp bằng Western blot.
Phương pháp tinh sạch bằng cột Ni - NTA dựa vào liên kết ái lực giữa ion niken (Ni2+) với vòng imidazole của histidine. Khi các acid amin histidine ở gần nhau thì liên kết giữa chúng với các ion niken càng mạnh. Protein tái tổ hợp do gen seb mã hoá có đuôi His - tag với 6 acid amin histidine liên tục sẽ liên kết đặc hiệu với ion niken. Các phân tử protein trong tế bào được tổng
hợp ra do không có đuôi His - tag sẽ không gắn được với ion niken. Protein tái tổ hợp được giữ lại trên cột sẽ được tách ra khi cho qua dung dịch đệm có chứa nồng độ imidazol thích hợp. Việc thu mẫu được tiến hành theo từng phân đoạn liên tục để kiểm tra protein ngoại lai bắt đầu tách ra khỏi cột từ phân đoạn nào và kết thúc ở phân đoạn nào.
Kết quả tinh sạch protein SEB sau 5 giờ cảm ứng 0,1mM IPTG, ở nhiệt độ 30oC được thể hiện trong hình 3.5
Kết quả trên điện di đồ cho thấy, sản phẩm tinh sạch chỉ có một băng protein duy nhất (ở các giếng 3,4,5,6,7,8) với trọng lượng khoảng 28 kDa tương đương trọng lượng của băng biểu hiện trước khi tinh sạch. Như vậy
Hình 3.5. Điện di đồ sản phẩm protein SEB tái tổ hợp tinh sạch.
1. Dịch phá protein SEB sau chảy qua cột
2. Phân đoạn rửa bằng Native Wash Buffer
3,4,5,6,7,8. Protein sau khi rửa Elution Buffer
chúng tôi đã thu được hoàn toàn lượng protein đích SEB tinh sạch để chuẩn bị cho việc định lượng protein thử hoạt tính kháng nguyên sau này.
3.3. Định lƣợng protein theo phƣơng pháp Bradford
Phương pháp Bradford cho kết quả rất nhanh, chính xác và các mẫu có thể được kiểm tra lại trong vòng vài phút. Phương pháp này được khuyến khích sử dụng để xác định hàm lượng protein. Khảo nghiệm Bradford khá nhạy cảm với albumin huyết thanh bò, nhiều hơn so với protein khác. IgG (Immunoglogin gamma globulin) là protein tiêu chuẩn.
Trong dung dịch mang tính axit khi chưa kết nối với protein SEB thì thuốc nhuộm ở dạng màu đỏ có bước sóng hấp thụ cực đại là 465 nm và khi kết hợp với protein SEB thì thuốc nhuộm chuyển sang màu xanh dương và hấp thụ cực đại ở bước sóng 595 nm. Độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm có liên hệ một cách trực tiếp với nồng độ protein. Để xác định protein trong mẫu, đầu tiên ta xây dựng một đường chuẩn với dung dịch protein chuẩn đã biết nồng độ. Lượng protein trong mẫu dung dịch đo được xác định bằng cách dựa vào đường chuẩn từ đó suy ra giá trị nồng độ protein tương ứng trên trục hoành.
Đầu tiên, chúng tôi đã tiến hành dựng đồ thị chuẩn BSA với thang chuẩn từ 0 - 100 µg. Kết quả đo độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm cho kết quả trong bảng 3.1. Từ kết quả đo độ hấp phụ chúng tôi đã xây dựng đường chuẩn và thiết lập được phương trình hồi quy tuyến tính: Y = 0.185X. (hình 3.6).
Từ các kết quả đo độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm của các phân đoạn protein SEB và phương trình hồi quy tuyến tính vừa xây dựng, nồng độ protein SEB trong các phân đoạn tinh sạch bằng cột Ni - NTA đã được xác định trong bảng 3.2.
Bảng 3.1. Kết quả đo độ hấp thụ BSA ở bước sóng 595 nm STT BSA (mg/ml) Elution Buffer (µl) BSA (µl) OD595nm 1 0 100 0 0 2 0,125 87,5 12,5 0,003 3 0,25 75 25 0,045 4 0,5 50 50 0,094 5 0,75 25 75 0,136 6 1 0 100 0,187
Hình 3.6. Đồ thị đường chuẩn định lượng protein bằng BSA có phương trình
Bảng 3.2. Nồng độ protein SEB sau tinh sạch
Kết quả định lượng protein SEB cho thấy, sản phẩm đã được tinh sạch, có nồng độ tương đối đồng đều ở các phân đoạn. Protein thu được ở các phân đoạn sau khi tinh sạch sẽ được trộn lẫn và đo OD595nm để xác định nồng protein trung bình ở dạng đột biến để phục vụ cho nghiên cứu tiếp theo. Kết quả nồng độ protein SEB là 1,278 mg/ml.
3.4. Kiểm tra độc tính của protein Staphylococcal enterotoxin B
Để khẳng định được protein SEB đột biến chúng tôi tạo ra đã mất độc tính nhưng vẫn giữ được tính kháng nguyên - kháng thể, chúng tôi tiến hành đánh giá độc tính của protein SEB trên chuột trước khi thực hiện thí nghiệm gây đáp ứng miễn dịch thu kháng huyết thanh. Trong thí nghiệm chúng tôi cũng đồng thời kiểm tra độc tính của protein SEB ở dạng tự nhiên để làm cơ sở so sánh và đánh giá độc tính của protein SEB dạng đột biến (protein SEB ở dạng tự nhiên do Phòng Công nghệ sinh học môi trường - Viện Công nghệ sinh học cung cấp).
3.4.1. Đánh giá độc tính giữa SEB tự nhiên (SEB1) và SEB đột biến (SEB2) ở liều tiêm 1xLD50 lên chuột (SEB2) ở liều tiêm 1xLD50 lên chuột
Bảng 3.3. So sánh số chuột chết sau tiêm SEB1 và SEB2 ở liều 1xLD50
Nhóm Số chuột chết/tổng
số chuột
Số chuột chết (%)
Nhóm 1 (tiêm ActD) 0/10 0
Nhóm 2 (tiêm ActD và SEB2 = 1xLD50) 0/10 0 Nhóm 5 (tiêm ActD và SEB1 = 1xLD50) 6/10 60
Kết quả bảng 3.3 cho thấy ở liều tiêm 1xLD50 (2,5 µg/g) của dung dịch SEB1 khi phối hợp với Actinomycin D liều 0,5 µg/g thì có 60% số chuột chết sau tiêm (nhóm 5) và không xuất hiện chuột chết ở hai nhóm còn lại (nhóm 1 tiêm Actinomycin D và nhóm 2 tiêm Actinomycin D kết hợp SEB2 ở liều 1x LD50).
3.4.2. Đánh giá độc tính giữa SEB tự nhiên (SEB1) và SEB đột biến (SEB2) ở liều tiêm 3xLD50 và 10xLD50 (SEB2) ở liều tiêm 3xLD50 và 10xLD50
Để kiểm tra xem liều lượng bao nhiêu có thể gây chết hoàn toàn đối với SEB tự nhiên và với liều lượng nào có thể gây ảnh hưởng hoàn toàn với SEB đột biến chúng tôi đã nâng liều tiêm lên tới 3xLD50 và 10xLD50.
Bảng 3.4. So sánh số chuột chết sau tiêm SEB1 và SEB2 ở liều 3xLD50 và 10xLD50 Nhóm Số chuột chết/tổng số chuột Số chuột chết (%) Nhóm 1 (tiêm ActD) 0/10 0
Nhóm 3 (tiêm ActD và SEB2 = 3xLD50) 0/10 0 Nhóm 4 (tiêm ActD và SEB2 = 10xLD50) 0/10 0 Nhóm 6 (tiêm ActD và SEB1 = 3xLD50) 10/10 100
Kết quả bảng 3.4 cho thấy khi nâng liều tiêm tới 10xLD50 với Actinomycin D liều 0,5 µg/g dung dịch SEB2 vẫn không gây chết chuột; trong khi dung dịch SEB1 chỉ cần tiêm ở liều 3xLD50 với Actinomycin D liều 0,5 µg/g đã làm chết 100% số chuột thử nghiệm (nhóm 6).
3.4.3. Biến động số lƣợng chuột nghiên cứu của mỗi nhóm trong 7 ngày
Hình 3.8. Hình dõi biến động số chuột theo ngày của các nhóm nghiên cứu
Kết quả hình 3.7 và 3.8 cho thấy ở các nhóm 1, nhóm 2, nhóm 3 và nhóm 4 không thấy xuất hiện chuột chết sau tiêm chất thử nghiệm trong 7 ngày theo dõi. Nhóm 5 bắt đầu xuất hiện chuột chết từ ngày thứ 2 và ngày thứ 3, từ ngày thứ 4 không có thêm chuột chết; tổng số chuột chết của nhóm 5 là 6/10 bằng 60% (ứng với liều tiêm 1xLD50). Nhóm 6 bắt đầu xuất hiện chuột chết từ ngày thứ 2 và ngày thứ 3, tổng số chuột chết của nhóm 6 là 10/10 bằng 100%. Theo các nghiên cứu trước cho biết, với các động vật nhỏ như chuột nhắt trắng trong phòng thí nghiệm, không thể tiêm với lượng lớn dung dịch thử nghiệm vì sẽ làm phù phổi và suy tạng gây chết động vật trước khi đánh giá độc tính, cần phải phối hợp với Actinomycin D để giảm liều và giảm lượng dung dịch thử nghiệm đưa vào cơ thể chuột. Actinomycin D với liều 0,5 µg/g cân nặng không gây chết chuột thí nghiệm nhưng giúp làm tăng tính độc và giảm liều của chất thử nghiệm 100 lần so với khi dùng đơn độc chất thử nghiệm [28]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng Actinomycin D kết hợp với dung dịch SEB1 và SEB2 và đã tìm được liều lượng thích hợp đưa vào cơ thể chuột để đánh giá khách quan độc tính của 2 dung dịch trên.
Từ các kết quả trên cho thấy dung dịch protein tái tổ hợp SEB2 không gây chết chuột ở mức liều tương đương 10xLD50 trong khi dung dịch SEB1 gây chết 60% động vật thí nghiệm ở mức liều 1xLD50 và làm chết 100 % động vật thí nghiệm ở mức liều 3xLD50.
3.5. Đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch trên chuột của kháng nguyên Staphylococcal enterotoxin B
3.5.1. Gây đáp ứng miễn dịch trên chuột Balb/C
Để chuẩn bị cho việc gây đáp ứng miễn dịch trên chuột cái Balb/C nhằm tạo ra kháng thể đa dòng phục vụ cho việc đánh giá tính kháng nguyên của protein tái tổ hợp SEB, chúng tôi tiến hành lựa chọn 20 chuột cái Balb/C thuần chủng (4 tuần tuổi) khỏe mạnh, đồng đều nhau về trọng lượng và đặc biệt là không nhiễm độc tố SEB được chia làm 2 lô thí nghiệm, mỗi lô 10 con. Các bước gây đáp ứng miễn dịch được thực hiện như sau: Kháng nguyên SEB sau khi được tinh sạch qua cột Niken được trộn với tá dược toàn phần FCA