Theo thiết kế vector biểu hiện seb/pET21a+, khi protein SEB được tổng hợp, nó sẽ nối thêm 6 acid amin Histidine ở đầu (-COOH). Đây là một đặc điểm thuận lợi cho việc tinh sạch sản phẩm, đồng thời cũng là một tín hiệu để nhận biết sản phẩm được tổng hợp bằng Western blot.
Phương pháp tinh sạch bằng cột Ni - NTA dựa vào liên kết ái lực giữa ion niken (Ni2+) với vòng imidazole của histidine. Khi các acid amin histidine ở gần nhau thì liên kết giữa chúng với các ion niken càng mạnh. Protein tái tổ hợp do gen seb mã hoá có đuôi His - tag với 6 acid amin histidine liên tục sẽ liên kết đặc hiệu với ion niken. Các phân tử protein trong tế bào được tổng
hợp ra do không có đuôi His - tag sẽ không gắn được với ion niken. Protein tái tổ hợp được giữ lại trên cột sẽ được tách ra khi cho qua dung dịch đệm có chứa nồng độ imidazol thích hợp. Việc thu mẫu được tiến hành theo từng phân đoạn liên tục để kiểm tra protein ngoại lai bắt đầu tách ra khỏi cột từ phân đoạn nào và kết thúc ở phân đoạn nào.
Kết quả tinh sạch protein SEB sau 5 giờ cảm ứng 0,1mM IPTG, ở nhiệt độ 30oC được thể hiện trong hình 3.5
Kết quả trên điện di đồ cho thấy, sản phẩm tinh sạch chỉ có một băng protein duy nhất (ở các giếng 3,4,5,6,7,8) với trọng lượng khoảng 28 kDa tương đương trọng lượng của băng biểu hiện trước khi tinh sạch. Như vậy
Hình 3.5. Điện di đồ sản phẩm protein SEB tái tổ hợp tinh sạch.
1. Dịch phá protein SEB sau chảy qua cột
2. Phân đoạn rửa bằng Native Wash Buffer
3,4,5,6,7,8. Protein sau khi rửa Elution Buffer
chúng tôi đã thu được hoàn toàn lượng protein đích SEB tinh sạch để chuẩn bị cho việc định lượng protein thử hoạt tính kháng nguyên sau này.