2.1.1. Đối tƣợng thí nghiệm
- Động vật thí nghiệm gồm 60 chuột nhắt cái trắng khỏe mạnh, không dị tật, có trọng lượng từ 20 ± 2 g/con, khoảng 6 - 8 tuần tuổi được nuôi 3 ngày ổn định trước thử nghiệm tại phòng nuôi động vật của Bộ môn Miễn dịch học, Học viện Quân Y để sử dụng cho việc kiểm tra độc tính của protein SEB đột biến.
- Chuột Balb/C thuần chủng từ 4 - 6 tuần tuổi, trọng lượng trung bình là 8 - 20 g sử dụng cho thí nghiệm gây đáp ứng miễn dịch.
2.1.2. Chủng vi khuẩn và plasmid
- Protein tái tổ hợp SEB dạng tự nhiên đã tinh sạch do phòng Công nghệ sinh học môi trường - Viện Công nghệ sinh học cung cấp.
- Vector pET21a+ mang gen seb đột biến được bảo quản trong tủ ở nhiệt độ -80o
C; tế bào vi khuẩn Escherichia coli BL21(DE3) được sử dụng cho mục đích biểu hiện protein SEB do Phòng Công nghệ sinh học môi trường - Viện Công nghệ sinh học cung cấp.
2.1.3. Các bộ kit
- Kít tách chiết Plasmid (GeneJettmPlasmid Miniprep kit, Fermentas). - Kít tinh sạch protein (Purification Protocols của hãng Invitrogen).
2.1.4. Hóa chất, máy móc và thiết bị
Các hóa chất chính được sử dụng: Bacto pepton, yeast extract, NaCl,
agarose, glucose, trypton, KCl, Tris HCl, EDTA, NaOH, MgSO4, MgCl2, glycerol, CaCl2, BSA, ethanol 70%, Reagent Bradford, các dung dịch đệm muối phosphate, nước khử ion. Kháng sinh ampicillin và các loại hóa chất thông dụng khác (ethidium bromide,.v.v.), thang chuẩn DNA, protein
(Fermentas (Mỹ)), các loại enzym cắt giới hạn (EcoRI, HindIII), Taq DNA polymerase được mua từ các hãng Fermentas, Invitrogen, Merck, Sigma, do Phòng Công nghệ sinh học môi trường - Viện Công nghệ Sinh học cung cấp.
Hóa chất sử dụng cho phản ứng Western blot: màng PVDF, Tris-HCl,
Glycine, Methanol, Dung dịch Ponceau, Cộng hợp kháng IgG chuột gắn Horseradish peroxidase (HRP), cơ chất 4-chloro-1-naphtol.
Thiết bị sử dụng: Bộ điện di DNA (Labnet), hệ thống máy chạy Western
blot của Biorad, lò vi sóng (Sanyo (Nhật Bản)), máy soi DNA (Mini- transllumminatior, Bio-Rad, Mỹ), máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thụy Điển), máy Vortex (Mimishaker, IKA, CHLB Đức), máy hút chân không Speed-Vac 110A (Savant, Mỹ), máy ly tâm, máy xung điện Gen Pulser, cùng với các trang thiết bị khác của Phòng Công nghệ sinh học môi trường và Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen quốc gia, Viện Công nghệ sinh học.
2.1.5. Môi trƣờng và đệm
Môi trường cho vi khuẩn và các loại đệm sử dụng trong nghiên cứu được chuẩn bị theo Sambrook và cs (2001) [29] hoặc theo sự hướng dẫn của nhà sản xuất.
2.1.6. Phần mềm
Xử lý số liệu bằng Exel, Gel Doc - IT System (hệ thống ghi hình ảnh và phân tích gel sau điện di protein).
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu 2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu
Hình 2.1. Sơ đồ các bước nghiên cứu
2.2.2. Các phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.2.1. Phƣơng pháp biến nạp vào tế bào khả biến Escherichia coli
BL21(DE3)
Nguyên lý:
Biến nạp là quá trình chuyển DNA trực tiếp vào tế bào nhận, những tế bào có khả năng tiếp nhận DNA được gọi là tế bào khả biến. Quá trình này gồm 2 giai đoạn: tạo tế bào khả biến và biến nạp.
Tiến hành:
- Bổ sung 2,5 µl DNA plasmid vào 100µl BL21, trộn hỗn hợp trên trong eppendorf (epp) 2ml.
- Đặt ổn định hỗn hợp trong đá 15 phút.
- Sốc nhiệt ở 42oC trong vòng 90 giây sau đó để trong đá 15 phút.
- Bổ sung 300 µl môi trường LB lỏng, nuôi lắc với tốc độ 220 v/p trong vòng 60 phút nhiệt độ 37oC ở thiết bị nuôi lắc ổn định.
- Cấy trải 50 - 150 µl mẫu trên môi trường thạch LB chứa kháng sinh ampicillin 100 mg/l (tỉ lệ kháng sinh với LB là 1:1000).
- Nuôi cấy trong tủ ấm 37oC, qua đêm.
2.2.2.2. Phƣơng pháp tách DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn E. coli
BL21(DE3)
Nguyên lý:
Phương pháp tách chiết DNA plasmid dựa trên nguyên lý sử dụng các hóa chất (SDS, NaOH) có tác dụng phá vỡ cấu trúc thành tế bào vi khuẩn và gây biến tính các phân tử protein. Khi thay đổi pH của dịch chiết tế bào bằng dung dịch có chứa kali acetat, các phân tử protein và DNA hệ gen sẽ bị kết tủa, tách ra khỏi dung dịch bằng li tâm tốc độ cao. DNA plasmid được tủa lại bằng ethanol 100% hoặc isopropanol. Lượng RNA còn tồn tại trong dung dịch chứa DNA plasmid được loại bỏ bằng cách bổ sung Rnase.
Tiến hành:
- Nuôi lỏng khuẩn lạc trong 3 ml môi trường LB lỏng có bổ sung 3 µl amppicillin, nuôi lắc qua đêm (khoảng 12 - 16 giờ).
- Lấy 1400 µl dịch khuẩn đã nuôi qua đêm đó cho vào eppendorf 2ml, ly tâm 8000 v/p trong 2 phút ở 25oC. Thu lấy cặn vi khuẩn ở đáy ống. Lặp lại bước trên 1 lần nữa.
Dùng kit tách plasmid của hãng fermentas:
- Bổ sung: 250 µl Lysis solution đảo đều tay (invert).
- Bổ sung: 350 µl Neutralization solution, đảo đều tay (invert). - Ly tâm 12000 v/p trong 5 phút ở 25oC
- Chuyển sang cột spin column: chỉ hút pha trên (không hút dịch trắng). - Ly tâm 12000 v/p trong 1 phút, loại hết dịch phía dưới cột
- Bổ sung: 500 µl Wash Solution vào cột, ly tâm 12000 v/p trong 1 phút, sau đó loại dịch phần dưới.
- Lặp lại bước trên 1 lần nữa.
- Sau đó ly tâm 1 lần nữa để loại hết Wash Solution.
- Chuyển sang eppendorf 2 ml sạch. Bổ sung 50 µl Elution Buffer vào trung tâm cột, không được chạm vào màng.
- Để ở nhiệt độ phòng trong 2 phút, sau đó ly tâm 12000 v/p trong 2 phút, bỏ cột, ghi nhãn cho sản phẩm.
- Kết quả được điện di trên gel agarose.
- Bảo quản sản phẩm trong tủ ở nhiệt độ -20oC để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
2.2.2.3 Phƣơng pháp xử lý enzym hạn chế
Nguyên lý:
Enzym hạn chế là các nuclease nội bào (endonuclease) có khả năng nhận biết và cắt các đoạn DNA tại các vị trí với trình tự nucleotide nhất định. Trong nghiên cứu này hai enzym hạn chế EcoRI và HindIII được sử dụng với mục đích để kiểm tra vector tái tổ hợp pET21a+ mang gen seb tách chiết từ các dòng tế bào vi khuẩn E. coli chủng BL21(DE3) sau khi được chuyển vector này. Về nguyên tắc thành phần phản ứng cắt enzym hạn chế không khác nhau, điểm khác nhau chỉ có là thể tích của các thành phần sẽ được điều chỉnh thích hợp với mỗi mục đích và DNA mẫu.
Phản ứng cắt kiểm tra vector tái tổ hợp pET21a+ mang gen seb tách chiết từ các dòng tế bào vi khuẩn E. coli chủng BL21(DE3) thực hiện với các thành phần như sau:
Thành phần phản ứng Thể tích (µl)
Nước khử ion vô trùng Đệm R (10X)
Enzym EcoRI (10u/µl) Enzym HindIII (10u/µl) Vector pET 21a+/SEB
2 1 1 1 5 Tổng thể tích 10
Thành phần phản ứng được trộn đều và tiến hành trong 2 giờ ở nhiệt độ 37oC, sản phẩm phản ứng được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%.
2.2.2.4. Biểu hiện protein Staphyloccoccal enterotoxin B trong tế bào vi khuẩn Escherichia coli chủng BL21(DE3) khuẩn Escherichia coli chủng BL21(DE3)
Nguyên lý:
E. coli BL21(DE3) là chủng biểu hiện mang gen mã hóa T7 RNA
polimerase trong genome. Khi trong môi trường có IPTG, enzym này sẽ được kích hoạt bám vào promoter của vector tái tổ hợp khởi động quá trình dịch mã sản xuất protein SEB.
Tiến hành:
- Nuôi lỏng khuẩn lạc mong muốn trong 15 ml môi trường LB lỏng có bổ sung 15 µl kháng sinh ampicillin ở nhiệt độ 37oC, lắc 200 v/p qua đêm.
- Hoạt hóa tế bào: Lấy 4,5 ml dịch khuẩn nuôi qua đêm chuyển sang 50 ml môi trường LB lỏng có bổ sung 50µl kháng sinh amp, nuôi ở 37oC, lắc 200 v/p trong 1 - 2 giờ sao cho OD đạt 0,6 - 0,8 thì tiến hành cảm ứng biểu
hiện với các điều kiện đã được tối ưu dựa theo công bố của tác giả Nghiêm Ngọc Minh và cs năm 2011 [6]. Chúng tôi tiến hành biểu hiện protein tái tổ hợp SEB ở nồng độ IPTG 0,1 mM, nhiệt độ 30o
C, thời gian cảm ứng là 5 giờ. + Bổ sung IPTG 0,1 mM vào dịch khuẩn thu được, nuôi lắc 200 v/p trong khoảng thời gian 5 giờ ở nhiệt độ 30o
C.
+ Sau 5 giờ, thu mẫu ra 2 falcon 50 ml (mỗi falcon chứa 25 ml dịch), chuẩn bị ly tâm.
+ Ly tâm 4000 v/p trong 15 phút, loại dịch thu cặn.
+ Sau đó bổ sung 3 ml NBB (Native Binding buffer) vào cặn (có tác dụng hồi sinh tế bào), đảo trộn bằng tay sau đó dồn vào 1 falcon 50ml, bỏ vào đá 10 phút, tiến hành siêu âm.
+ Siêu âm trong đá để phá tế bào bằng máy siêu âm với chu kì 20 giây/lần, nghỉ 20 giây trong 30 phút.
+ Hút dịch phá tế bào sau siêu âm ra các epp 1,5 ml để ly tâm 12000 v/p ở 4o
C trong 10 phút.
+ Thu dịch vào falcon 15 ml, cặn thu vào các epp. + Bảo quản trong tủ -20o
C để điện di kiểm tra.
+ Kết quả được điện di trên gel polyacrylamide (SDS - PAGE) để tiến hành kiểm tra.
2.2.2.5. Phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide
Nguyên lý chung:
Điện di là kĩ thuật được dùng để phân tách các protein dựa trên cơ sở kích thước, khối lượng, điện tích và cấu hình của chúng. Khi các phân tử tích điện được đặt trong một điện trường, chúng sẽ dịch chuyển hướng đến cực dương (+) hoặc cực âm (-) tùy theo điện tích của chúng.
Điện di protein được tiến hành trên gel polyacrylamide chuẩn bị với thành phần như bảng 2.1 và bảng 2.2.
Bảng 2.1. Công thức pha gel tách (12%)
Bảng 2.2: Công thức pha gel cô (5%)
Sau khi chuẩn bị xong gel tách và gel đế chúng tôi tiếp tục tiến hành theo các bước sau :
+ Đổ gel tách xuống dưới, chờ gel tách đông, đổ lên trên lớp gel cô, gài lược tạo giếng điện di.
Thành phần Nồng độ cuối các thành phần trong gel (12 %) Thể tích (10ml) dH2O vô trùng 3,3 30% Acrylamid 12 % 4,0 Tris-HCl 1,5 M; pH 8,8 0,375 M 2,5 10% SDS 0,1 % 0,1 10% APS 0,1 % 0,1 TEMED 0,002% 0,004 Thành phần Nồng độ cuối các thành phần trong gel (5 %) Thể tích (3ml) dH2O vô trùng 2,1 30% Acrylamid 5 % 0,5 Tris-HCl 1M; pH 6,8 0,13 M 0,38 10% SDS 0,1 % 0,03 10% APS 0,1 % 0,03 TEMED 0,001% 0,003
+ Tra mẫu vào giếng điện di theo thứ tự: M: Thang protein chuẩn; 1: Protein tổng số mẫu đối chứng (-) không cảm ứng IPTG; 2: Protein tổng số trong pha dich; 3: Protein tổng số trong pha cặn.
+ Chạy điện di với gel cô 80V trong 30 phút; sau đó với gel tách 100V trong 65 phút.
+ Sau đó, gỡ gel, nhuộm lắc 1 giờ trong dung dịch Staining. + Rửa nhuộm trong dung dịch De-Staining 2 lần mỗi lần 30 phút. + Soi dưới đèn và chụp lại kết quả.
2.2.2.6. Phƣơng pháp sạc cột Ni - NTA
Cột Ni - NTA resin có thể được sử dụng 3 lần cho việc tinh sạch protein. Rửa resin với NaOH 0,5M trong 30 phút và cân bằng resin bằng binding buffer nếu sử dụng lại.
Không nên sử dụng cột resin quá 3 lần và chỉ nên tái sử dụng nó cho cùng loại protein tinh sạch. Nếu thấy cột có màu trắng thì sạc lại resin (tái hoạt tính cho cột).
Cách sạc lại cột resin (quy trình cho 2 ml resin trong cột):
- Rửa cột 2 lần với 8 ml 50 mM EDTA, làm lơ lửng resin, để lắng, loại bỏ dịch.
- Rửa cột 2 lần với 8 ml 0,5M NaOH, làm lơ lửng resin, để lắng, loại bỏ dịch.
- Rửa cột 2 lần với 8 ml nước cất đã khử trùng, làm lơ lửng resin, để lắng, loại bỏ dịch.
- Rửa cột 2 lần với 8 ml NiCl2 (chuẩn bị NiCl2: 5mg/ml trong tủ vô trùng, dùng dH2O inbox), làm lơ lửng resin, để lắng, loại bỏ dịch.
- Rửa cột 2 lần với 8 ml nước cất, làm lơ lửng resin, để lắng, loại bỏ dịch. - Thêm 8 ml 20% ethanol vào cột, giữ ethanol trong cột.
- Bảo quản trong tủ 4oC.
2.2.2.7. Phƣơng pháp tinh sạch protein
Nguyên lý:
Protein tái tổ hợp thu được dưới dạng dung hợp có đuôi His - tag nên dễ dàng tinh sạch thông qua phương pháp sắc kí ái lực sử dụng cột nickel.
Tiến hành:
- Phần dịch nổi có chứa protein tái tổ hợp được đưa lên cột Nickel- Chelating Resin đã chuẩn bị trước.
- Loại bỏ dịch nổi qua đêm trong cột tinh sạch.
- Cho 8 ml dịch phá protein vào cột, đảo nhẹ, giữ lơ lửng resin trong vòng 1 giờ.
- Lắng resin bằng trọng lực, thu dịch nổi, ký hiệu: Part 1, giữ ở 4oC. - Cho 6 ml Native Wash Buffer với thành phần: 50 ml dung dịch đệm tinh sạch (Native purification buffer) (250 mM NaH2PO4, pH= 8.0, 2.5M NaCl), 335 μl dung dịch imidazole 3 M, pH 6.0, chuẩn pH 8.0, đảo nhẹ lơ lửng resin, để lắng, thu dịch nổi, ký hiệu Part 2.
- Lặp lại bước trên 2 lần, thu dịch nổi, ký hiệu: Part 2.1, Part 2.2.
- Bổ sung 9 ml Native Elution Buffer, thu 6 phân đoạn, ký hiệu lần lượt: 1, 2, 3, 4, 5, 6.
Các dịch nổi (phân đoạn) thu được sau tinh sạch được kiểm tra bằng phương pháp điện di gel polyacrylamide.
2.2.2.8. Định lƣợng protein theo phƣơng pháp Bradford
Nguyên lý:
Phương pháp Bradford là một phương pháp nhanh chóng xác định số lượng lượng protein trong một mẫu do nhà khoa học Marion M. Bradford phát triển và được cấp bằng sáng chế năm 1976 [13]. Phương pháp này dựa vào sự thay đổi màu xảy ra khi Coomassie Brilliant Blue G-250 liên kết với protein mục tiêu trong dung dịch axit. Dạng proton hoá của thuốc nhuộm Coomassie Blue có màu đỏ da cam. Thuốc nhuộm liên kết chặt chẽ với các protein, tương tác với cả nhóm kỵ nước và các nhóm mang điện tích dương trên phân tử protein. Trong môi trường của các gốc mang điện tích dương, sự proton hoá không xảy ra và có màu xanh xuất hiện. Các protein khi phản ứng xanh Coomassie sẽ hình thành hợp chất màu có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595 nm (hấp thụ cực đại ở bước sóng này).
Đặc điểm của phản ứng:
- Cường độ màu tỉ lệ với nồng độ protein trong dung dịch. Nồng độ Protein càng cao thì màu xanh càng đậm.
- Không phụ thuộc vào nồng độ acid amin của dung dịch.
- Phương pháp có độ nhạy cao cho phép phát hiện tới vài microgam protein/ml. Nhạy hơn phương pháp Lowry gấp 4 lần.
- Dễ phát hiện và tiết kiệm thời gian.
- Ít bị ảnh hưởng bởi các chất thường gặp trong tế bào như muối.
Để xác định protein trong mẫu, đầu tiên ta xây dựng một đường chuẩn với dung dịch protein chuẩn đã biết được nồng độ. Dung dịch protein chuẩn thường là bovine serum albumin (BSA). Sau khi cho dung dịch protein vào
dung dịch thuốc nhuộm, màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền tới 1 giờ. Tiến hành đo mật độ quang hỗn hợp bằng máy quang phổ kế.
Tiến hành:
1) Chuẩn bị hóa chất:
+ Native Elution Buffer (dung dịch đệm đẩy)
+ BSA 1 mg/ml (albumin huyết thanh bò). Từ BSA 1 mg/ml pha ra các nồng độ khác nhau như bảng 2.3:
Bảng 2.3. Pha Nồng độ pha dung dịch BSA
BSA 1 mg/ml (µl) Elution Buffer (µl) Tổng (µl)
0 (0µl) 100 100 0,125 (12,5µl) 87,5 100 0,25 (25µl) 75 100 0,5 (50µl 50 100 0,75 (75µl) 25 100 1 (100 µl) 0 100
- Pha dung dịch Reagent Bradford (thuốc thử bradford) : Hòa tan 100 mg Coomassie Brilliant Blue G-250 trong 50 ml etanol 95%, thêm 100ml 85% (w/v) axit photphoric. Pha loãng đến 1 lít khi thuốc nhuộm đã hòa tan hoàn toàn, và lọc qua giấy Whatman # 1 ngay trước khi sử dụng.
- Các mẫu protein đã tinh sạch.
2) Dựng đường chuẩn BSA:
Bảng 2.4. Kí hiệu tên các eppendorf ở các nồng độ
A1(01) A2(02) A3(03)
0,125.1 0,125.2 0,125.3
0,25.1 0,25.2 0,25.3
0,5.1 0,5.2 0,5.3
0,75.1 0,75.2 0,75.3
1.1 1.2 1.3
- Cho vào các ống (01), (02), (03) 20µl NEB (Native Elution Buffer), 980µl thuốc thử Reagent Bradford làm đối chứng; và bổ sung vào mỗi ống eppendorf còn lại hỗn hợp 20µl BSA, 980µl thuốc thử Reagent Bradford.
- Tiến hành đo các mẫu trên ở bước sóng 595 nm.