* Vi khuẩn Pseudomonas
Là những loại vi khuẩn phổ biến gây bệnh ở động vật và con người. Nó được tìm thấy trong đất, nước và trên các môi trường nhân tạo. Vi khuẩn không chỉ phát triển trong môi hiếu khí, mà còn có thể sống trong môi trường yếm khí.
- Đặc điểm hình thái và tính chất bắt màu
Trực khuẩn thẳng hoặc hơi cong, hai đầu tròn, kích thước 0.5 - 1µm x 1 - 5 µm. Có lông ở một đầu, vi khuẩn có thể di động được, ít khi có vỏ và không sinh nha bào. Khi nhuộm bắt màu Gr-.
- Đặc tính nuôi cấy
Trực khuẩn mủ xanh mọc dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, hiếu khí. Nhiệt độ thích hợp 37o
C, nhưng phát triển được ở nhiệt độ 5 - 420C, pH thích hợp 7,2 - 7,5 nhưng phát triển được ở pH 4,5 - 9,0 + Trên môi trường đặc: Có thể gặp 2 loại khuẩn lạc: 1 loại to, nhẵn, dẹt, trung tâm hơi lồi. Có xu hướng mọc lan, 1 loại xù xì bờ không đều, đôi khí có loại khuẩn lạc nhầy.
+ Trên môi trường thạch máu đa số gây tan máu. Trong các nuôi cấy từ bệnh phẩm thường gặp loại khuẩn lạc thứ nhất. Trong các nuôi cấy từ môi trường thường gặp loại khuẩn lạc thứ hai.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
+ Trong môi trường lỏng vi khuẩn mọc thành váng ở trên. Trực khuẩn Pseudomonas mọc được ở trên môi trường SS (shigella salmonella).
- Đặc tính sinh hóa học
+ Pseudomonas sử dụng một số loại đường bằng hình thức oxy hóa có sinh acid như glucose, mannitol, arabinose, galactose, fructose.
+ Không lên men đường lactose.
+ Phản ứng: Oxydase (+); citrat-cimmons (+); catalase (+). + Phản ứng: Indol (-); H2S (-); LDC (-); Urease (-).
1.5. Hiện tƣợng kháng thuốc ở vi khuẩn
Sự ra đời của kháng sinh và liệu pháp kháng sinh đã góp phần quan trọng trong việc đấu tranh chống lại bệnh nhiễm trùng ở nhân y cũng như ở thú y. Nhưng nó cũng đã và đang thể hiện những mặt bất cập, đặc biệt là hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn làm cho các thuốc trước đây có tác dụng diệt khuẩn hoặc kìm khuẩn mạnh đối với vi khuẩn, thì giờ đây đã hoàn toàn không còn tác dụng gì nữa. Hay một số thuốc mới ra đời tỏ ra có tính ưu việt nhưng chẳng bao lâu chúng đa bị vi khuẩn kháng lại. Từ thực tế này đã hướng nhiều nhà nghiên cứu trong nước cả về nhân y và thú y: một số tác giả tiến hành các nghiên cứu về tình hình kháng kháng sinh của một số loại vi khuẩn. Các kết quả nghiên cứu đều cho thấy tình trạng kháng kháng sinh ngày một lan rộng và ngày càng có nhiều loại kháng sinh bị mất tác dụng kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn hay giết chết các vi khuẩn gây bệnh.
Theo Nguyễn Phước Tương (2001) [45] trong thú y học người ta đã nhận thấy hiện tượng vi khuẩn đề kháng với nhiêu loại kháng sinh, trong đó có Penicillin, Cephalosporin, Chloramphenicol, Tetracylin, Colimycin, Tetramycin, Erythromycin, Kanamycin, Neomycin và Gentamicin.
Nguyễn Văn Thanh (1999) [31] tiến hành kiểm tra tính mẫn cảm và khả năng kháng thuốc của các vi khuẩn phân lập từ dịch viêm đường sinh dục trâu cái cho thấy:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Vi khuẩn Staphylococcus có tỷ lệ kháng thuốc cao nhất với Furazolidon (44,44%), sau đó đến Streptomycin (38,89%), Penicillin (27,78%), Sulphonamid và Neomycin (16,67%)…
Vi khuẩn Streptococcus có tỷ lệ kháng thuốc cao nhất với Furazolidon (44,44%), sau đó đến Streptomycin (33,33%), Penicillin và Ampicillin (27,78%), Chloramphenicol (22,22%)…
Vi khuẩn E.coli có tỷ lệ kháng (100%) với Penicillin, (33,33%) với Chloramphanicol, (27,78%) với Streptomycin và Furalidon…
Cũng theo nghiên cứu này vi khuẩn Salmonella có mức độ kháng tới (100%) với 2 loại kháng sinh là Penicillin và Sulphonamid, mức độ kháng Ampicillin là (71,43%). Một số kháng sinh như: Chloramphanicol, Streptomycin, Neomycin… thì không bị Salmonella kháng.
Gần đây năm 2007, theo một công trình nghiên cứu của Bùi Thị Tho và Nguyễn Thị Thanh Hà [39]. Vi khuẩn E.coli và Salmonella phân lập từ phân chó bị viêm ruột tiêu chảy cấp tính cho thấy, Penicillin bị kháng tới (100%), Ampicillin bị kháng (77,78%), Erythromycin bị kháng (55,56%), Gentamicin, Ofloxacin, Chloramphenicol bị 2 loại vi khẩn này kháng (22,22%).
Ngoài ra các tác giả Phạm Khắc Hiếu, Bùi Thị Tho (1978) [12]; Nguyễn Văn Dịp (1997) [7]; Bùi Thị Tho (1996) [37], cũng đã quan tâm tìm hiểu hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn và đã có các nghiên cứu về vấn đề kháng thuốc của các loại vi khuẩn: Pseudomonas, Staphylococcus, E.coli…
1.6. Các loại kháng sinh sử dụng trong nghiên cứu của khóa luận
Với mục đích xác định tính mẫn cảm của các loại vi khuẩn phân lập được từ dịch tử cung, âm đạo của lợn nái bị bệnh và thử hiệu quả của các loại thuốc kháng sinh với các loại vi khuẩn trên. Dựa trên nghiên cứu của một số tác giả về tính mẫn cảm kháng sinh của các loại vi khuẩn gây viêm dường sinh dục ở lợn và trâu bò. Chúng tôi tiến hành tìm hiểu và lựa chọn 9 loại
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
kháng sinh để dùng trong nghiên cứu của khóa luận gồm các loại kháng sinh: Penicillin, Ampicillin, Neomycin, Norfloxacin, Gentamicin, Tetracyclin, Streptomycin, Doxycyclin và Oxytetracyclin.
1.6.1. Kháng sinh Penicillin và Ampicillin
* Kháng sinh Penicillin
Theo Phạm Đức Chương (2003) và cs [4], Bùi Thị Tho (2003) [38], Penicillin là kháng sinh đầu tiên được tìm ra bởi Alexander Fleming vào năm 1928.
- Công thức cấu tạo
Phân tử Penicillin gồm hệ thống vòng hỗn hợp β lactam thiazolidine. S CH3 RCONH CH3 N O COOH Penicillin - Cơ chế tác dụng
Penicillin có tác dụng diệt khuẩn bằng cách ngăn cản sự tổng hợp vách của tế bào vi khuẩn, phá vỡ tình trạng nguyên vẹn của vách tế bào.
- Tính chất kháng khuẩn
Penicillin có tác dụng tốt với nhiều loại liên cầu khuẩn (Streptococcus),
tụ cầu khuẩn (Staphylococcus). Ngoài ra chúng còn có tác dụng trên một số trực khuẩn Gr-
và Gr+ như: Pastuerella multocida, Corybacterium. Một số
Clostridium, Leptospira… Chúng không có tác dụng với Pseudomonas, hầu hết các trực khuẩn đường ruột và tụ cầu khuẩn Staphylococcus tiết Penicillinase.
* Kháng sinh Ampicillin
Kháng sinh Ampicillin là các dẫn xuất bán tổng hợp có nhóm amin tự do ở vị trí α trên R của penicillin.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Ampicillin có tác dụng đối với các vi khuẩn mẫn cảm với penicillin tự nhiên, chúng cũng có tác dụng đối với một số vi khuẩn đường ruột: E.coli, Salmonella, Proteus mirabilis và không có tác dụng đối với Pseudomonas.
1.6.2. Kháng sinh Neomycin, Gentamicin và Streptomycin
Theo tác giả Phạm Đức Chương và cs (2003) [4], 3 loại kháng sinh Neomycin, Gentamicin và Streptomycin là 3 kháng sinh thuộc nhóm kháng sinh Aminoglycoside. Kháng sinh nhóm này được lựa chọn để điều trị nhiễm khuẩn nặng do vi khuẩn Gr-
gây ra.
* Công thức hóa học của Neomycin CH2NH2 NH2 NH2 OH O HO O OH HOCH2 O CH2NH2 OH HO O NH2 OH
* Công thức của Gentamicin C1
CH3 CHNHCH3 NH2 O NH2 OH O HO O O NHCH3 H3C OH
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
* Cơ chế tác dụng
Tác dụng kháng khuẩn của Aminoglycoside là bằng cách gắn không đặc hiệu vào tiểu phận 30S của riboxom vi khuẩn và bằng cách đó tác động đến quá trình dịch mã của Marn. Tác động đến sự sao chép của AND vi khuẩn.
1.6.3. Kháng sinh Tetracyclin, Doxycyclin và Oxytetracyclin
Các kháng sinh Tetracyclin, Doxycyclin và Oxytetracyclin thuộc nhóm kháng sinh Tetracyclin. Nhóm kháng sinh này được phân lập từ nhiều loại nấm Streptomyces khác nhau vào cuối những năm 1940.
Tetracyclin là hợp chất lưỡng tính có 4 vòng, khác nhau do thay thế các gốc hóa học ở các điểm khác nhau trên vòng.
* Cơ chế tác dụng
Tetracyclin có tác dụng kháng khuẩn bằng cách gắn vào tiểu phần 30S của riboxom ở vi sinh vật mẫn cảm. Sau khi gắn vào riboxom, tetracyclin ngăn cản aminoacyl gắn vào phức hợp Marn/ribisome, bằng cách đó ngăn cản sự tổng hợp protein của vi khuẩn, vi khuẩn không phát triển và nhân lên được.
* Kháng sinh Tetracyclin Công thức cấu tạo
H3C CH3
HO CH3 N
OH
OH OH O OH O
Tetracyclin dùng liều 10mg/ kg cách 8 giờ/ lần cho hiệu quả điều trị cao với các nhiễm khuẩn do Pseudomonas và Brucella gây ra.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
* Oxytetracyclin Công thức cáu tạo
(CH3)2
HO CH3 OH N
OH
OH CONH2 OH O OH O
Theo Phạm Sỹ Lăng và Lê Thị tài (1997) [16], kháng sinh Oxytetracyclin thấm tốt vào tổ chức phổi, thận cũng như dịch phế quản, có tác dụng tốt với các nhiễm khuẩn Streptococcus, Corynebacterium, hạn chế tác dụng với một số Staphylococcus aureus, không tác dụng với Pseudomonas.
Thuốc có tác dụng kéo dài và thời gian bán thải dài.
* Doxycyclin Công thức hóa học H3C CH3 HO CH3 OH N OH OH CONH2 OH O OH O
Doxycyclin được sử dụng điều trị các bệnh nhiễm khuẩn đường hô hấp và E.coli. Thuốc có thể thấm vào bên trong tế bào nên có tác dụng mạnh với vi khuẩn ở bên trong tế bào.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
1.6.4. Kháng sinh Norfloxacin
Là kháng sinh thuộc nhóm Fluoroquynolone cáo tác dụng ức chế enzym AND gyase, enzym tham gia vào vòng xoắn AND vì vậy ức chế tổng hợp AND của vi khuẩn.
* Công thức cấu tạo
1 ethyl - 6 fluoro, 1,4 dihydro 4 oxo - 7 - (1 piperziny) - 3 - quinolone carboxylic acid. O F COOH N N C2H5 N H
Norfloxacin có tác dụng chủ yếu trên các cầu khuẩn, trực khuẩn và tụ cầu khuẩn: E.coli, Salmonella, Proteus, Yersia, Pseudomonas, Streptococcus, Staphylococcus spp…Thuốc có tác dụng kéo dài sau khi sử dụng ở một số loại vi khuẩn trên.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
- Lợn nái sinh sản ở các lứa tuổi, được nuôi tại một số trang trại chăn nuôi lợn nái ngoại tập trung tại địa bàn Thành phố Thái Nguyên.
- Các loại vi khuẩn gây bệnh viêm tử cung ở lợn. - Các loại kháng sinh dùng trong nghiên cứu.
2.2. Vật liệu nghiên cứu
- Mẫu bệnh phẩm:
+ Dịch rỉ viêm tử cung, âm đạo.
+ Dịch tử cung âm đạo của lợn nái bình thường. * Vật liệu nghiên cứu:
+ Môi trường dùng cho nuôi cấy vi khuẩn: Thạch máu, thạch huyết thanh, MacConkey, Gelatin…
+ Các loại hoá chất và môi trường thử phản ứng lên men đường:
Lactoza, Saccaroza, Maltoza…
+ Thuốc nhuộm Gram, dung dịch chỉ thị màu: Thuốc nhuộm tím Gentian, dung dịch fucsin kiềm…
+ Kháng huyết thanh chuẩn.
+ Các khoanh giấy thử kháng sinh.
+ Các dụng cụ, máy móc, trang thiết bị phòng thí nghiệm: Tủ ấm, tủ lạnh, kính hiển vi …
2.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Địa bàn nghiên cứu: Một số trang trại chăn nuôi lợn nái ngoại tập trung tại địa bàn Thành phố Thái Nguyên.
- Labor xét nghiệm: Phòng thí nghiệm khoa Vi sinh vật - Bệnh viện Đa khoa trung ương Thái Nguyên.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 7 năm 2009 đến tháng 07 năm 2010.
2.4. Nội dung nghiên cứu
2.4.1. Tình hình bệnh viêm tử cung của lợn tại thành phố Thái Nguyên tỉnh Thái Nguyên trong 3 năm từ năm 2008 đến năm 2010 tỉnh Thái Nguyên trong 3 năm từ năm 2008 đến năm 2010
- Tỷ lệ lợn bị bệnh viêm tử cung (tính chung).
- Tỷ lệ lợn bị bệnh viêm tử cung dục theo tuổi sinh sản. - Tỷ lệ lợn bị bệnh viêm tử cung theo các mùa trong năm.
2.4.2. Xác định thành phần và tỷ lệ các loại vi khuẩn nuôi cấy và phân lập được từ dịch tử cung, âm đạo của lợn nái bình thường và lợn nái bị bệnh được từ dịch tử cung, âm đạo của lợn nái bình thường và lợn nái bị bệnh viêm tử cung
- Thành phần và tỷ lệ các loại vi khuẩn phân lập được từ chất tiết đường sinh dục của lợn nái bình thường.
- Thành phần và tỷ lệ các loại vi khuẩn phân lập được từ dịch viêm tử cung, âm đạo của lợn bị bệnh viêm tử cung.
2.4.3. Xác định mức độ mẫn cảm kháng sinh của các loại vi khuẩn phân lập được lập được
- Xác định mức độ mẫn cảm kháng sinh của cácvi khuẩn Streptococcus
phân lập được.
- Xác định mức độ mẫn cảm kháng sinh của các vi khuẩn Salmonella
phân lập được.
- Xác định mức độ mẫn cảm kháng sinh của các vi khuẩn E.coli phân lập được.
- Xác định mức độ mẫn cảm kháng sinh của các vi khuẩn
Staphylococcus phân lập được.
- Xác định mức độ mẫn cảm kháng sinh của các vi khuẩn Pseudomonas
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Xác định mức độ mẫn cảm kháng sinh của các vi khuẩn của tập đoàn vi khuẩn trong dịch tử cung, âm đạo của lợn nái bị viêm tử cung.
2.4.4. Theo dõi sự thay đổi một số chỉ tiêu lâm sàng của lợn nái mắc bệnh viêm tử cung viêm tử cung
2.4.5. Theo dõi ảnh hưởng của bệnh viêm tử cung đến năng suất sinh sản của lợn nái của lợn nái
2.4.6. Khảo nghiệm mối quan hệ giữa tỷ lệ lợn nái mắc bệnh viêm tử cung và tỷ lệ lợn con phân trắng
và tỷ lệ lợn con phân trắng
2.4.7. Thử nghiệm một số phác đồ điều trị bệnh
2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.5.1. Phương pháp điều tra số lợn, mắc bệnh viêm đường sinh dục tại các trang trại chăn nuôi lợn ngoại tập trung tại TP Thái Nguyên. trang trại chăn nuôi lợn ngoại tập trung tại TP Thái Nguyên.
Điều tra tình hình dịch bệnh viêm tử cung của lợn qua số liệu của 2 trại chăn nuôi và tự lập phiếu điều tra.
Nội dung điều tra gồm: - Xây dựng phiếu điều tra.
- Xác định số lợn mắc bệnh tại thời điểm điều tra. - Xác định số lợn chết vì bệnh tại thời điểm điều tra.
- Lợn nghi mắc bệnh được điều tra căn cứ vào triệu chứng lâm sàng và chẩn đoán bệnh tích.
2.5.2. Phương pháp lấy mẫu
* Lấy mẫu và bảo quản mẫu bệnh phẩm
Theo Nguyễn Phúc Quý và cs (1991) [27], với lợn bị bệnh đang sống và chết vì nghi mắc bệnh: lấy dịch dỉ viêm bằng tăm bông và một số dụng cụ khác, sau đó đưa mẫu vào ống nghiệm chứa dung dịch PBS, đậy nút, ghi nhãn, đánh số thứ tự, địa điểm lấy mẫu… Mẫu được bảo quản trong đá lạnh ở nhiệt độ 2 - 8°C và được mang về phòng thí nghiệm để tiến hành xét nghiệm sau 1 - 2 giờ.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.5.3. Phương pháp nuôi cấy, phân lập vi khuẩn
Để xác định sự biến đổi vi khuẩn học của vi khuẩn trong dịch viêm tử cung của lợn chúng tôi tiến hành lấy mẫu dịch tử cung, âm đạo (Lợn sau đẻ 12 -24 giờ và lợn mắc bệnh). Mẫu bệnh phẩm được kiểm tra theo các phương pháp nghiên cứu vi khuẩn học của các tác giả: Phạm Kim Anh (1991) [1]; Nguyễn Phúc Quý và cs (1991) [27] và Nguyễn Như Thanh (1974) [29].
Mẫu bệnh sau khi lấy về được phân lập và nuôi cấy trên các môi trường phù hợp như: Thạch máu, thạch huyết thanh, MacConkey, Gelatin… các vi khuẩn được nuôi cấy trong thời gian 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ ở 37o
C. Tùy thuộc vào loại môi trường và vi khuẩn khác nhau.
Sau khi chọn các khuẩn lạc điển hình đem xác định, kiểm tra hình thái vi khuẩn, các tính chất sinh hóa, lên men các loại đường.
2.5.4. Phương pháp làm kháng sinh đồ và xác định tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh của các loại vi khuẩn
Phương pháp xác định khả năng mẫn cảm với các loại kháng sinh của các loại vi khuẩn được nhiều tác giả nghiên cứu như: Phạm Kim Anh (1991) [1]; Nguyễn Phúc Quý và cs (1991) [27]… Trong nghiên cứu này chúng tôi áp dụng phương pháp kháng sinh đồ trên đĩa thạch theo Kirby - Bauer, FAO (1994), dùng giấy tẩm kháng sinh của hãng Oxoid (Anh) sản xuất và một số
