4. í nghĩa của đề tài
2.1.Đối tƣợng, địa điểm, thời gian nghiờn cứu
2.1.1. Đối tượng nghiờn cứu
- Lợn cỏc lứa tuổi ở 3 huyện: Định Hoỏ, Phỳ Lƣơng và Phổ Yờn. - Bệnh giun kết hạt ở lợn.
2.1.2. Địa điểm nghiờn cứu
- Địa điểm triển khai: Huyện Định Hoỏ, Phỳ Lƣơng và Phổ Yờn – Thỏi Nguyờn. - Địa điểm xột nghiệm mẫu: Phũng thớ nghiệm Khoa chăn nuụi thỳ y - Trƣờng Đại học Nụng Lõm Thỏi Nguyờn,.
- Địa điểm xột nghiệm mẫu mỏu, làm tiờu bản vi thể: Bệnh viện Đa khoa Trung ƣơng Thỏi Nguyờn.
2.1.3. Thời gian nghiờn cứu
Từ thỏng 8/2009 đến thỏng 8/2010
2.2. Vật liệu nghiờn cứu
2.2.1. Mẫu nghiờn cứu
- Mẫu phõn tƣơi của lợn cỏc lứa tuổi nuụi tại một số địa phƣơng của huyện Định Hoỏ, Phỳ Lƣơng và Phổ Yờn – Thỏi Nguyờn.
- Mẫu cặn nền chuồng, mẫu đất bề mặt xung quanh chuồng nuụi, mẫu đất bề mặt vƣờn trồng cõy thức ăn cho lợn.
- Lợn bị bệnh giun kết hạt.
- Trứng giun kết hạt phõn lập từ phõn lợn ở tỉnh Thỏi Nguyờn. - Mẫu mỏu của lợn khoẻ và lợn mắc bệnh giun kết hạt.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.2.2. Hoỏ chất và dụng cụ thớ nghiệm
- Kớnh hiển vi quang học, buồng đếm Mc. Master, mỏy ảnh. - Dụng cụ thuỷ tinh: cốc, lọ, đũa thuỷ tinh, lam kớnh, lamen. - Dụng cụ mổ khỏm: kộo, dao, khay mổ và một số vật dụng khỏc.
- Hoỏ chất: dung dịch muối NaCl bóo hoà, dung dịch Barbagallo (gồm: Formol 38%: 30ml, NaCl tinh khiết: 7,5 g; nƣớc cất: 1000 ml).
- Thuốc tẩy giun kết hạt:
+ Thuốc Nova – Levasol, đúng gúi 100g, trong 1000g thƣơng phẩm cú chứa 100.000 mg Levamisol HCl và tỏ dƣợc vừa đủ (sản phẩm của Cụng ty ANOVA).
+ Thuốc Hanmectin – 25, đúng lọ 10ml, trong 1ml thƣơng phẩm cú chứa 2,5mg Ivermectin và tỏ dƣợc vừa đủ (sản phẩm của Cụng ty cổ phần thuốc thỳ y Trung ƣơng I).
2.3. Nội dung nghiờn cứu
2.3.1. Đặc điểm dịch tễ bệnh giun kết hạt ở lợn
2.3.1.1. Tỡnh hỡnh nhiễm giun kết hạt lợn ở một số địa phương thuộc tỉnh Thỏi Nguyờn.
- Thành phần loài giun trũn giống Oesophagostomum ký sinh ở lợn tại 3 huyện Định Hoỏ, Phỳ Lƣơng và Phổ Yờn.
- Tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm giun kết hạt lợn ở cỏc địa phƣơng - Tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm giun kết hạt theo tuổi lợn
- Tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm giun kết hạt theo mựa vụ
- Tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm giun kết hạt theo phƣơng thức chăn nuụi
2.3.1.2. Nghiờn cứu sự ụ nhiễm, sự tồn tại của trứng và ấu trựng giun kết hạt lợn ở ngoại cảnh lợn ở ngoại cảnh
- Sự ụ nhiễm trứng giun kết hạt ở nền chuồng, xung quanh chuồng nuụi và vƣờn trồng cõy thức ăn cho lợn.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Sự phỏt triển của trứng giun kết hạt thành ấu trựng cảm nhiễm trong phõn lợn. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Khả năng sống của ấu trựng Oesophagostomum sp. cảm nhiễm trong phõn lợn.
- Sự phỏt triển của trứng giun kết hạt ở lớp đất bề mặt cú độ ẩm khỏc nhau. - Khả năng sống của ấu trựng cảm nhiễm trong đất bề mặt cú độ ẩm khỏc nhau.
2.3.2. Nghiờn cứu bệnh lý và lõm sàng bệnh giun kết hạtở lợn
- Tỷ lệ lợn nhiễm giun kết hạt cú biểu hiện lõm sàng của bệnh. - Một số chỉ số mỏu của lợn bị bệnh giun kết hạt và lợn khoẻ. - So sỏnh cụng thức bạch cầu của lợn khoẻ và lợn bị bệnh giun kết hạt. - Tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm giun kết hạt giữa lợn tiờu chảy và lợn khỏe. - Xỏc định mối tƣơng quan giữa số lƣợng giun kết hạt ký sinh ở lợn và số trứng giun kết hạt trong một gam phõn.
- Bệnh tớch đại thể và vi thể ở cơ quan tiờu hoỏ của lợn bị bệnh giun kết hạt.
2.3.3. Nghiờn cứu phũng trị bệnh giun kết hạtcho lợn
- Thử nghiệm thuốc tẩy giun kết hạt cho lợn trờn diện hẹp. - Thử nghiệm thuốc tẩy giun kết hạt cho lợn trờn diện rộng. - Đề xuất quy trỡnh phũng trị bệnh giun kết hạt cho lợn.
2.4. Phƣơng phỏp nghiờn cứu
2.4.1. Quy định một số yếu tố dịch tễ
- Tuổi lợn: chia thành 4 lứa tuổi. < 2 thỏng
2 – 4 thỏng 4 - 6 thỏng > 6 thỏng
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Mựa vụ: nghiờn cứu ở 2 mựa vụ trong năm.
+ Vụ Hố - Thu: từ thỏng 5/2009 đến thỏng 10/2009 + Vụ Đụng - Xuõn: từ thỏng 11/2009 đến thỏng 4/2010
- Phƣơng thức chăn nuụi: nghiờn cứu ở 2 phƣơng thức chăn nuụi lợn. + Phƣơng thức truyền thống: hộ gia đỡnh chăn nuụi với số lƣợng ớt, thức ăn cho lợn chủ yếu là cỏc phế phụ phẩm tận dụng của ngành trồng trọt (khoai, sắn, bột ngụ, cỏm xỏt, rau xanh).
+ Phƣơng thức cụng nghiệp: chăn nuụi với số lƣợng lớn, thức ăn cho lợn là thức ăn tổng hợp, hệ thống chuồng trại khỏ hiện đại, điều kiện vệ sinh thỳ y tốt.
2.4.2. Phương phỏp lấy mẫu
Mẫu đƣợc thu thập theo phƣơng phỏp lấy mẫu chựm nhiều bậc (mẫu đƣợc thu thập ở ba huyện, mỗi huyện thu thập ở 3 xó), mẫu đƣợc lấy ngẫu nhiờn ở cỏc hộ và cỏc trang trại chăn nuụi lợn.
Kết quả xột nghiệm mẫu đƣợc tổng hợp, mụ tả và phõn tớch.
- Mẫu phõn: Lấy mẫu phõn mới thải của lợn ở cỏc lứa tuổi với lƣợng
20 – 30 g/mẫu. Để riờng mỗi mẫu phõn vào một tỳi nilon sạch, mỗi tỳi đều cú nhón ghi: tờn chủ hộ, thời gian, địa điểm lấy mẫu, tuổi lợn, trạng thỏi phõn, phƣơng thức chăn nuụi, trạng thỏi cơ thể và biểu hiện lõm sàng (nếu cú). Những thụng tin này đƣợc ghi vào nhật ký đề tài. Mẫu đƣợc xột nghiệm ngay trong ngày hoặc bảo quản trong điều kiện lạnh 2 – 80
C (khụng quỏ 3 ngày).
- Mẫu cặn nền chuồng: Tại mỗi ụ chuồng lấy mẫu cặn ở 4 gúc và ở
giữa ụ chuồng, trộn đều đƣợc một mẫu xột nghiệm (khoảng 80 – 100g/mẫu). Mỗi mẫu đƣợc để riờng trong tỳi nilon cú ghi nhón: tờn chủ hộ, địa điểm, thời gian lấy mẫu. Mẫu đƣợc xột nghiệm ngay trong ngày.
. - Mẫu đất bề mặt xung quanh chuồng nuụi: Trong khoảng bỏn kớnh 5 m
xung quanh chuồng lợn, cứ 10 – 15 m2
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn
khối lƣợng từ 80 – 100 g, đƣợc trộn đều bởi 4 mẫu ở 4 gúc và 1 mẫu ở giữa. Mỗi mẫu đƣợc để riờng trong tỳi nilon cú ghi nhón: tờn chủ hộ, địa điểm, thời gian lấy mẫu.
- Mẫu đất ở vườn, bói trồng cõy thức ăn cho lợn: Cứ 10 – 15 m2 lấy một mẫu đất bề mặt. Một mẫu cú khối lƣợng từ 80 – 100 g, đƣợc phối hợp bởi 4 mẫu ở 4 gúc và 1 mẫu ở giữa. Mỗi mẫu đƣợc để riờng trong tỳi nilon cú ghi nhón: tờn chủ hộ, địa điểm, thời gian lấy mẫu.
- Mẫu mỏu: Lấy mẫu mỏu lợn khoẻ và lợn bị bệnh giun kết hạt, mỗi lợn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
lấy 1 ml mỏu ở hốc mắt.
- Mẫu bệnh phẩm: Lấy những đoạn ruột già của lợn bị bệnh giun kết hạt cú
bệnh tớch điển hỡnh, sau đú cố định bệnh phẩm bằng dung dịch Formol 10 %.
2.4.3. Phương phỏp xột nghiệm mẫu
Chỳng tụi tiến hành xột nghiệm mẫu phõn lợn theo phƣơng phỏp
Fulleborn:
+ Cỏch pha nƣớc muối bóo hoà: Đun sụi nƣớc, cho 380 gam muối NaCl vào, khuấy đều đến khi muối khụng tan đƣợc nữa, khi để nguội trờn mặt cú lớp muối kết tinh. Lọc qua vải màn hoặc bụng, bỏ cặn.
+ Cỏch làm: Lấy 5 – 10 gam phõn cho vào một cốc nhỏ, dựng đũa thuỷ tinh nghiền nỏt, cho khoảng 40 – 50 ml dung dịch nƣớc muối bóo hoà vào, dựng đũa thuỷ tinh khuấy tan, sau đú lọc qua lƣới thộp, bỏ cặn. Cho dung dịch vừa lọc vào cỏc lọ nhỏ đầy đến miệng lọ, đậy phiến kớnh lờn miệng lọ cho tiếp xỳc với dung dịch muối bóo hoà, để yờn 20 - 30 phỳt, trứng giun sẽ nổi lờn và bỏm vào phiến kớnh, soi phiến kớnh dƣới kớnh hiển vi tỡm trứng giun kết hạt.
2.4.4. Phương phỏp xỏc định tỷ lệ và cường độ nhiễm giun kết hạt
- Phương phỏp xỏc định tỷ lệ nhiễm giun kết hạt
Tất cả cỏc mẫu phõn, mẫu cặn nền chuồng, mẫu đất bề mặt xung quanh chuồng và vƣờn trồng cõy thức ăn cho lợn đều đƣợc xột nghiệm bằng phƣơng
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn
phỏp Fulleborn với dung dịch muối NaCl bóo hoà, tỡm trứng giun kết hạt dƣới kớnh hiển vi, độ phúng đại 100 lần, Những mẫu cú trứng giun kết hạt đƣợc đỏnh giỏ là cú nhiễm, ngƣợc lại là khụng nhiễm.
- Phương phỏp xỏc định cường độ nhiễm giun kết hạt
Đếm số trứng giun kết hạt trong 1g phõn bằng buồng đếm Mc.Master. Cƣờng độ nhiễm đƣợc xỏc định bằng số trứng/gam phõn.
Cỏch làm: Lấy 2 gam phõn cho vào 58ml dung dịch nƣớc muối bóo hoà, khuấy tan phõn, lọc bỏ cặn. Khuấy đều nƣớc lọc rồi dừng lại đột ngột, dựng pipep hỳt và bơm vào đầy buồng đếm Mc.Master (gồm 2 buồng đếm). Hai buồng đếm cú 6 ụ, kớch thƣớc mỗi buồng 1 cm x 1 cm. Sau 15 phỳt, trứng đƣợc đẩy lờn bề mặt dung dịch buồng đếm. Đếm tất cả số trứng giun kết hạt trong buồng đếm (0,15ml/1 buồng).
Số trứng/g phõn = Tổng số trứng ở 2 buồng đếm x 15
Quy định cỏc cƣờng độ nhiễm nhẹ, trung bỡnh, nặng và rất nặng nhƣ sau: ≤ 400 trứng/g phõn: nhiễm nhẹ (+)
> 400 – 800 trứng/g phõn: nhiễm trung bỡnh (++) > 800 – 1200 trứng/g phõn: nhiễm nặng (+++) > 1200 trứng/g phõn: nhiễm rất nặng (++++)
2.4.5.Phương phỏp xỏc định loài giun kết hạt ký sinh ở lợn
Mổ khỏm lợn bị bệnh giun kết hạt, thu thập giun kết hạt ký sinh, bảo quản trong dung dịch Barbagallo. Định loài theo khoỏ định loại của Skrjabin và cs (1963) [44], Nguyễn Thị Lờ và cs (1996) [23].
2.4.6. Phương phỏp xỏc định thời gian phỏt triển, tồn tại của trứng và ấu trựng giun kết hạtở ngoại cảnh
- Trong phõn lợn
Lấy phõn của những lợn bị nhiễm giun kết hạt nặng cho vào 20 chậu nhựa cú đƣờng kớnh 15 cm và chiều cao 10 cm (mỗi chậu đƣợc coi là một mẫu,
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn
khoảng 400 – 500 g phõn), trong đú 10 mẫu đƣợc theo dừi ở mựa hố với t0
= 27- 310C và ẩm độ A0
= 75 – 85%, 10 mẫu cũn lại theo dừi ở mựa đụng với t0 = 17 - 220C và ẩm độ A0
= 55 – 70%.
Hàng ngày lấy khoảng 3 – 5 g phõn/mẫu, xột nghiệm bằng phƣơng phỏp Fulleborn tỡm trứng giun kết hạt. Đếm số trứng trờn một vi trƣờng vi và số ấu trựng cú sức gõy bệnh, từ đú tớnh ra tỷ lệ ấu trựng cú sức gõy bệnh/trứng + ấu trựng giun kết hạt và thời gian phỏt triển của ấu trựng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Vẫn duy trỡ theo dừi lụ thớ nghiệm trờn trong điều kiện nhƣ đó trỡnh bày. Tuy nhiờn, do thời gian tồn tại của ấu trựng cú sức gõy bệnh cú thể kộo dài. Vỡ vậy, kể từ khi tất cả trứng đó nở và phỏt triển thành ấu trựng cú sức gõy bệnh, cứ 5 ngày xột nghiệm một lần để xỏc định chỉ tiờu này.
Cỏch xột nghiệm: Mỗi lần lấy 3 - 5g phõn/mẫu, xột nghiệm bằng phƣơng
phỏp ly tõm lấy cặn tỡm ấu trựng cú sức gõy bệnh, đếm số ấu trựng/3 vi trƣờng và đếm số ấu trựng chết, từ đú tớnh đƣợc tỷ lệ ấu trựng chết theo thời gian theo dừi.
- Trong đất
Lấy cỏc mẫu đất khụng bị nhiễm trứng giun trũn kết hạt (qua kết quả xột nghiệm) ở khu vực khỏc nhau và cỏc mẫu đất cú khả năng giữ ẩm khỏc nhau cho vào chậu nhựa đƣờng kớnh 35 cm, chiều cao 18 cm, cỏc chậu đất đƣợc xỏc định độ ẩm bằng phƣơng phỏp:
- Phương phỏp xỏc định ẩm độ của đất
Theo Lờ Văn Khoa và cs (1996) [8], độ ẩm của đất đƣợc tớnh theo cụng thức: Wt (%) = (a/b) x 100
Trong đú: a - lƣợng nƣớc mất sau khi sấy (g) b - khối lƣợng đất trƣớc khi sấy Wt (%) - ẩm độ của đất (%) Lấy một lƣợng 20 – 30 g đất sấy 105o
C cho đến khi khối lƣợng giữa cỏc lần cõn khụng đổi thỡ dừng lại và tớnh ẩm độ của đất theo cụng thức trờn.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn - Phương phỏp theo dừi sự phỏt triển của trứng giun giun kết hạt ở lớp đất bề mặt cú độ ẩm khỏc nhau
Phõn thành 5 lụ thớ nghiệm, tƣơng ứng với 5 mức ẩm độ khỏc nhau: < 10%, 10 - 20%, 20 - 30%, 30 - 40%, > 40%. Mỗi chậu đất đều đƣợc nghi rừ: ẩm độ, thời gian bắt đầu thớ nghiệm.
Đặt trứng giun kết hạt thu nhận đƣợc từ phõn mới thải vào lớp đất bề mặt ở mỗi lụ thớ nghiệm. Mỗi lụ thớ nghiệm bố trớ 5 chậu đất, coi mỗi chậu đất là một mẫu theo dừi. Hàng ngày 8 – 10 gam đất bề mặt từ mỗi chậu ra, xột nghiệm bằng phƣơng phỏp Fulleborn, soi kớnh ở độ phúng đại 100 lần. Từ đú xỏc định đƣợc thời gian phỏt triển thành ấu trựng cú sức gõy bệnh của trứng giun kết hạt trong đất.
- Phương phỏp theo dừi khả năng sống của ấu trựng cảm nhiễm trong đất cú ẩm độ khỏc nhau
Bố trớ 5 lụ thớ nghiệm với 5 mức ẩm độ đất nhƣ trờn. Bằng phƣơng phỏp Baerman thu nhận ấu trựng giun kết hạt cú sức gõy bệnh, sau đú đặt lƣợng lớn ấu trựng vào lớp đất bề mặt ở mỗi lụ thớ nghiệm. Cứ 5 ngày lấy 8 – 10 gam đất bề mặt xột nghiệm để xỏc định thời gian sống của ấu trựng bằng phƣơng phỏp lắng cặn.
Hàng ngày dựng bỡnh phun sƣơng bổ sung nƣớc để đảm bảo ẩm độ của đất quy định.
2.4.7. Phương phỏp theo dừi cỏc biểu hiện lõm sàng của lợn bị bệnh giun kết hạt Chỳng tụi sử dụng cỏc phƣơng phỏp chẩn đoỏn cơ bản để phỏt hiện những biểu hiện khỏc thƣờng của lợn: thể trạng, niờm mạc trạng thỏi phõn, ăn uống, vận động…
2.4.8. Phương phỏp xột nghiệm mỏu để xỏc định một số chỉ số huyết học của lợn khoẻ và lợn bị bệnh giun kết hạt
- Số lƣợng hồng cầu, bạch cầu, hàm lƣợng huyết sắc tố đƣợc xỏc định trờn mỏy ABX Micros tại phũng huyết học – Bệnh viện Đa khoa Trung ƣơng Thỏi Nguyờn.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Cụng thức bạch cầu đƣợc xỏc định bằng phƣơng phỏp Tristova: làm tiờu bản mỏu, nhuộm Giemsa, đếm số lƣợng từng loại bạch cầu và tớnh tỷ lệ phần trăm mỗi loại.
2.4.9. Phương phỏp xỏc định mối tương quan giữa số lượng giun kết hạt ký sinh với số trứng trong một gam phõn
- Xột nghiệm và đếm số trứng giun kết hạt trong một gam phõn của 18 lợn bị bệnh giun kết hạt bằng phƣơng phỏp đếm trứng trờn buồng đếm Mc. Master.
- Mổ khỏm toàn diện cơ quan tiờu hoỏ của 18 lợn trờn và đếm số giun kết hạt ký sinh trờn mỗi lợn.
- Số liệu thu thập đƣợc xử lý trờn mỏy vi tớnh theo chƣơng trỡnh Statgraph Version 4.0 (1994) Statistic Company of USA.
2.4.10. Phương phỏp xỏc định bệnh tớch đại thể và những biến đổi vi thể ở cơ quan tiờu hoỏ do giun kết hạt gõy ra
- Bệnh tớch đại thể đƣợc xỏc định bằng cỏch quan sỏt kỹ những tổn thƣơng ở ruột của những lợn nhiễm giun kết hạt.
- Nghiờn cứu biến đổi bệnh lý vi thể bằng phƣơng phỏp làm tiờu bản tổ chức học theo quy trỡnh tẩm đỳc parafin, nhuộm Hematoxylin – Eosin, đọc