3. Nội dung nghiên cứu
2.2.PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phân lập gen
2.2.1.1. Phương pháp tách chiết RNA
Phƣơng pháp tách chiết RNA tổng số: Sử dụng bộ kit Trizol Reagents (Hãng Invitrogen) để tách chiết RNA tổng số từ các lá mầm của ngô theo chỉ dẫn của nhà sản xuất gồm các bƣớc:
Nghiền nhanh 100mg mẫu trong nitơ lỏng.
Thêm 1ml Trizone Regents, đảo nhẹ đều trong 5 phút.
Thêm 200µl chloroform/isoamyl alcohol (24:1), đảo đều ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
Ly tâm 10000 vòng trong 15 phút ở 4ºC.
Thu 500 µl dịch nổi sang ống eppendoft 1,5ml.
Thêm 500 µl Isopropanol lạnh, đảo đều 15 phút ở nhiệt độ phòng (hoặc để ở -20ºC trong 30 phút).
Ly tâm 10000 vòng trong 15 phút ở 4ºC, thu tủa.
Thêm 700 µl cồn lạnh 70% (pha bằng dH2O + 0,01% DEPC). Ly tâm 6000 vòng trong 5 phút ở 4ºC. Lặp lại 2 lần.
Làm khô RNA trong box.
Kiểm tra sản phẩm RNA tổng số tách chiết đƣợc bằng điện di trên gel agarose 0,8% và đo bằng máy NanoDrop (Lite Spectophotometer).
2.2.1.2. Phương pháp tổng hợp cDNA
Bảng 2.2: Thành phần cho phản ứng tổng hợp cDNA
STT Thành phần Thể tích ( µl)
1 RNA tổng số (10-20 ng/μl) 5
2 Priemere random hexamine (250ng) 1
3 DEPC Water 6
Tổng thể tích 12
Ủ ở 65°C trong 5 phút, sau đó cho ngay vào đá lạnh trong 5 phút.
Bổ sung các thành phần sau: Reaction Buffer (5X) 4µl; dNTP (10mM) 2µl; Ribolock Rnase Inhibitor (20u/µl) 1µl; RevertAid H Minus Reverse Transcriptase (200u/ µl) 1 µl.
Ủ trong máy PCR ở các mức nhiệt độ sau: Ủ 25°C trong 5 phút – 42°C trong 60 phút- 70°C trong 5 phút, bƣớc cuối ủ ở 4°C.
2.2.1.3. Phương pháp PCR
cDNA của gen Cystatin đƣợc khuếch đại bằng kĩ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu theo thành phần phản ứng và chu trình nhiệt nhƣ sau:
Bảng 2.3: Thành phần của phản ứng PCR nhân gen Cystatin
STT Thành phần Nồng độ
1 Nƣớc khử ion 12,5 µl
2 Đệm PCR 10X 2,5 µl
3 MgCl2 (25mM) 2,5 µl
4 dNTPs (25mM) 2,5 µl
5 Mồi xuôi (10pmol/µl) 1 µl
6 Mồi ngƣợc (10pmol/µl) 1 µl
7 Taq DNA polymerase (5 đơn vị/ µl) 1 µl
8 cDNA khuôn (10-20 ng/µl) 2 µl
Bảng 2.4: Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR nhân gen Cystatin
Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ ( ºC) Thời gian Chu kì
1 Biến tính 95 4 phút 1
2 Biến tính 95 30 giây
35
3 Gắn mồi 58 30 giây
4 Kéo dài chuỗi 72 30 giây
5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1
6 Kết thúc phản ứng 4 ∞
2.2.1.4. Phương pháp thôi gel
Quá trình thôi gel, tinh sạch đƣợc thực hiện theo quy trình và bộ hóa chất sử dụng cho tinh sạch của hãng QIAGEN (QIAquick DNA Gel Extraction Kit), gồm các bƣớc sau:
- Thêm buding buffer và sản phẩm PCR tỉ lệ 1: 1, ủ 55ºC trong 10 phút. - Chuyển sang cột lọc li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút 30 giây. - Bổ sung Wash buffer li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút 30 giây. - Chuyển cột lọc sang ống Eppendorf 1,5 ml mở nắp 5 phút.
- Bổ sung nƣớc khử ion để 5 phút li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút 30 giây thu dịch bảo quản ở -20ºC.
2.2.1.5. Phương pháp ghép nối gen vào plasmid
Bảng 2.5: Thành phần gắn gen Cystatin vào vector tách dòng pBT
STT Thành phần Thể tích (µl)
1 H2O 2
2 Buffer 10x 1
3 Enzyme ligation (1U/μl) 1
4 pBT (150ng/µl) 1
Bổ sung lần lƣợt các thành phần của phản ứng vào ống Eppendoft 0,5ml ủ ở 22°C trong 3h.
Đặt phản ứng trong đá và chuẩn bị thực hiện quá trình biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α.
2.2.1.6. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào E.coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt
Nguyên lý
Tế bào E.coli , tức là có khả
năng thu nhận DNA plasmid. Tế bào vi khuẩn đƣợc đƣa ra từ tủ âm 80°C sẽ đƣợc đặt trên đá, sau đó sốc nhiệt bằng cách cho vào bể ổn nhiệt 42°C. Lúc này bề mặt thành tế bào sẽ xuất hiện các lỗ nhỏ đủ để cho DNA plasmid đi vào. Sau khi plasmid đi vào trong tế bào, thành tế bào sẽ trở về trạng thái nguyên vẹn ban đầu.
Chuẩn bị tế bào khả biến E.coli DH5α
Tế bào E.coli DH5α đƣợc cấy ria trên môi trƣờng LB đặc và nuôi qua đêm ở 37°C.
Cấy 1 khuẩn lạc E.coli vào môi trƣờng 5ml LB lỏng, lắc 200 vòng/phút, ở 37ºC, qua đêm.
Chuyển 0,5 ml dịch tế bào sang 50 ml môi trƣờng LB, tiếp tục nuôi lắc 200 vòng/ phút, ở 37ºC cho tới khi OD600 đạt 0,4 -0.6. Sau đó, lấy mẫu ra và đặt vào đá khoảng 1h. Từ bƣớc này tất cả các thao tác đều phải đƣợc tiến hành ở 4°C.
Ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút, thu tế bào. Hòa tế bào bằng 50ml nƣớc khử ion, lạnh vô trùng.Lặp lại 2 lần. Ly tâm 4000 vòng/ phút trong 10phút, thu tủa.
Hòa tế bào thu đƣợc trong 50ml CaCl2 100 mM (lạnh, vô trùng). Ủ mẫu 15 phút và ly tâm thu tế bào ở 4000 vòng/phút trong 10 phút.
Hòa tủa trong 25 ml CaCl2 100 mM, ủ mẫu 60 phút trong đá để cation hóa các lỗ trên màng tế bào vi khuẩn.
Ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút ở 4°C.
Hòa tế bào trong 0,5 ml CaCl2 100 mM, bổ sung glycerol 15% trộn đều. Tế bào trong dung dịch lúc này đã trở nên khả biến, dễ dàng cho DNA đi qua lỗ màng vào tế bào. Hút 0,1ml dịch tế bào trên vào mỗi ống Eppendorf và đƣợc làm lạnh nhanh bằng nitơ lỏng, bảo quản ở -80ºC.
Biến nạp bằng sốc nhiệt
Tế bào khả biến đƣợc lấy từ -80°C, làm tan dần trong đá trong khoảng 30 phút. , đảo nhẹ nhàng để DNA phân
bố đều trong dịch tế bào kh trong
đá 30 phút.
Sốc nhiệt bằng cách chuyển mẫu vào bể ổn nhiệt với nhiệt độ là 42ºC và ủ trong 90giây.
Lấy mẫu ra rồi đặt ngay vào đá trong 2 phút.
Bổ sung khoảng 500 - 600 µl LB lỏng vào mẫu lắc ở 37°C trong 45 - 50 phút. Ly tâm 5000rpm ở 25ºC trong 5 phút, loại bỏ gần hết dịch nổi, chỉ để lại khoảng 100µl dịch, trộn đều sinh khối lắng để thành dạng huyền phù tế bào.
Hút 100 µl dịch tế bào và cấy trải trên đĩa môi trƣờng LB đặc bổ sung carbenicillin 50mg/l, X-gal, Ampicillin.
Nuôi qua đêm ở 37ºC.
2.2.1.7. Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony- PCR)
Bảng 2.6: Thành phần của phản ứng colony - PCR STT Thành phần Nồng độ 1 Nƣớc khử ion 12,5 µl 2 Đệm PCR 10X 2,5 µl 3 MgCl2 (25mM) 2,5 µl 4 dNTPs (25mM) 2,5 µl
5 Mồi xuôi (10pmol/µl) 1 µl
6 Mồi ngƣợc (10pmol/µl) 1 µl
7 Taq DNA polymerase (5 đơn vị/ µl) 1 µl
8 Khuẩn lạc
Bảng 2.7: Chu trình nhiệt của phản ứng colony- PCR
Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ ( ºC) Thời gian Chu kì
1 Biến tính 95 4 phút 1
2 Biến tính 95 30 giây
35
3 Gắn mồi 58 30 giây
4 Kéo dài chuỗi 72 30 giây
5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1
6 Kết thúc phản ứng 4 ∞
2.2.1.8. Phương pháp tách plasmid tái tổ hợp
Vector tái tổ hợp đƣợc tách chiết theo phƣơng pháp tách chiết plasmid của Sambrook và Russell (2001) [42].
Bảng 2.8: Thành phần hóa chất tách chiết plasmid
STT Thành phần
Sol I 50 mM glucose, 25 mM Tris HCl pH 8, 10 mM EDTA pH 8
Sol II 0,2 NaOH, SDS 1%
Sol III 60 ml potassium acetate 5M; 11,5 ml glacial acetic acid; 28,5 ml H2O
Các bước tiến hành tách plasmid
Lấy 10 ml dung dịch vi khuẩn nuôi trong LB lỏng 12 - 16 giờ.
Ly tâm 8000 v/p thu tế bào, có thể lặp lại 5 lần để thu hết cặn khuẩn của 10 ml dịch khuẩn.
Bổ sung 200 µl Sol I hòa tan tế bào hoàn toàn. Bổ sung 400 µl Sol II tr n nhẹ trong 30 giây. Bổ sung tiếp 300 µl Sol III trộn nhẹ trong 30 giây.
Bổ sung 900 µl chloroform: isoamyl alcohol (24 : 1) trộn đều trong 3 phút.
Ly tâm 13000v/p, hút nhẹ nhàng 900µl pha dịch nổi trên sang ống Eppendorf mới.
Cho 900µl isopropanol 100% để ở nhiệt độ -4ºC trong 30 - 180 phút, ly tâm 13000 v/p, loại bỏ phần dịch lỏng, thu cặn.
Cho 500 µl cồn 70% vào, ly tâm 7000 v/p trong 5 phút, sau đó loại bỏ cồn và làm đông khô trong 30 phút.
Hòa tan sản phẩm trong 50 µl nƣớc khử ion, bổ sung Rnase. Ủ ở 37ºC trong 30 phút.
Kiểm tra sản phẩm tách plasmid bằng điện di trên gel agarose 0,8%.
Tinh sạch sản phẩm plasmid
Bổ sung 450µl nƣớc khử ion vào ống eppendoff đã có sẵn 50µl plasmid. Bổ sung thêm 500µl dung dịch chloroform: isoamyl alcohol (24:1), ly tâm 12000v/p ở 4ºC, trong 15 phút.
Hút 350µl dịch nổi cho sang ống Eppendoff 1,5ml, thêm 50µl CH3COONa, 350µl ethanol 100% đảo nhẹ, sau đó để vào tủ -20ºC, ủ trong 1h.
Ly tâm 12000v/p ở 4ºC, trong 15 phút, loại bỏ phần dịch lỏng, thu cặn. Thêm 500µl cồn 70%, ly tâm 12000v/p trong 15 phút, sau đó loại bỏ cồn (lặp lại 2 lần) và làm khô.
Bổ sung 40µl nƣớc khử ion và bảo quản ở -20ºC.
2.2.1.9. Phương pháp xác định trình tự nucleotide của gen
Trình tự của gen đƣợc xác định trên máy đọc trình tự nucleotide tự động ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer (Applied Biosystem) sử dụng bộ hoá chất sinh chuẩn BigDye®
Terminator v3.1 Cycle Sequencing.
2.2.2. Phản ứng lai ghép gen Cystatin2 (Cys2) với vector pENTRTM/D-TOPO®
Đoạn gen Cys2 tiếp tục đƣợc dòng hóa vào vector pENTRTM/D-TOPO® để tạo ra dòng entry pENTR/D mang Cys2 (kí hiệu pEN-Cys2) có chứa các vị trí tái tổ hợp attL. Đây là vị trí sẽ tái tổ hợp với attR trên pPhaso-dest khi có sự xúc tác của enzyme đặc hiệu.
Bảng 2.9: Thành phần phản ứng ghép nối gen Cys2
với vector pENTRTM/D-TOPO®
STT Thành phần Thể tích(μl) 1 Sản phẩm PCR tinh sạch 0,5 - 4 2 Salt solution 1 3 Vector pENTR 1 4 H2O khử ion 0 - 3,5 Tổng th tích 6 Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng (22 - 23ºC). Sau đó đặt ống dung dịch phản ứng trên đá và thực hiện quá trình biến nạp vào tế bào khả biến E.coli One Shot® Top 10.
Biến nạp plasmid tái tổ hợp pEN- gen vào tế bào khả biến E.coli One
Shot® Top 10.
(1) Bổ sung 2μl vector đã gắn gen vào ống đựng tế bào khả biến đã làm tan đá và trộn nhẹ bằng tay. Hỗn hợp đƣợc ủ trong đá 15 phút.
(2) Sốc nhiệt tế bào ở 42ºC trong 30 giây và chuyển ngay vào đá, để trên đá 10 phút.
(3) Bổ sung 250μl môi trƣờng LB lỏng ở nhiệt độ phòng. Hỗn hợp đƣợc nuôi lắc 200 v/p trong vòng 1 giờ ở 37ºC.
(4) Sử dụng que cấy trải đã khử trùng trải 50 - 200 μl dịch khuẩn biến nạp lên đĩa chọn lọc chứa kanamycine 50mg/l đƣợc làm ấm lại.
(5) Ủ đĩa petri ở 37ºC qua đêm trong vòng 16 giờ.
Chọn dòng khuẩn lạc bằng colony - PCR
Sau khi nuôi đĩa khuẩn đã biến nạp trên môi trƣờng chọn lọc, thấy xuất hiện khuẩn lạc trắng. Chọn ra một số khuẩn lạc trắng để chạy phản ứng colony - PCR với cặp mồi CYS-F và CYS-R nằm trên vector pENTRTM/D-
TOPO® để xác định khuẩn lạc có plasmid mang đoạn gen đã đƣa vào. Thành phần và chu kỳ nhiệt cũng giống nhƣ phản ứng PCR nhân gen mục (2.2.1), mẫu DNA đƣợc thay bằng khuẩn lạc. Sản phẩm đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% để chọn ra những khuẩn lạc mang gen có kích thƣớc nhƣ mong muốn. Sau đó tiến hành nuôi lỏng khuẩn lạc để tách chiết plasmid.
2.2.3. Phƣơng pháp tạo vector chuyển gen mang cấu trúc gen Cys2 bằng kỹ thuật Gateway thuật Gateway
Trong nghiên cứu này, sau khi thiết kế thành công vector nhân dòng pENTRTM/D-TOPO® mang đoạn gen quan tâm, chúng tôi tiến hành phản ứng tái tổ hợp LR giữa vector chuyển gen pPhaso-dest với plasmid pENTRTM
/D- TOPO® mang đoạn gen Cys2 (Hình 2.3). Các cấu trúc đều đƣợc kiểm soát sự
biểu hiện bởi promoter đặc trƣng trong hạt phasoline.
Hình 2.2: Sơ đồ minh họa phản ứng LR giữa pENTR- Cys2 với pPhaso-dest
Phản ứng LR đƣợc thực hiện với thành phần (Bảng 2.10) và theo các bƣớc sau:
Bảng 2.10: Thành phần phản ứng LR STT Thành phần Thể tích (μl) 1 Plasmid pEN-gene (50 - 150 ng) 2 2 Vector pPhaso-dest (150 ng/ μl) 2 3 TE 1X 4 Tổng 8 Các bước tiến hành:
(1) Bổ sung các thành phần trên vào ống ly tâm 1.5 ml ở nhiệt độ phòng và trộn nhẹ.
(2) Làm tan hỗn hợp enzyme LR ClonaseTM
trên đá khoảng 2 phút. Trộn nhẹ 2 lần, mỗi lần khoảng 2 giây.
(3) Bổ sung vào ống ly tâm 2 μl enzyme LR ClonaseTM
để phản ứng và đảo nhẹ nhàng 2 lần.
(4) Ủ phản ứng ở 25°C trong 1h. Bổ sung 1 μl dung dịch proteinase K để kết thúc phản ứng. Đảo nhẹ, ủ ở 37°C trong 10 phút.
Biến nạp
(1) Chuyển 3 μl phản ứng LR vào 50 μl tế bào E.coli One Shot®
Top 10.
(2) Ủ trong đá 30 phút. Sốc nhiệt tế bào ở 42ºC trong 45 giây. (3) Bổ sung 300 μl LB lỏng. Ủ ở 37ºC trong 1 giờ bằng máy lắc.
(4) Chuyển 50- 250 μl vào các đĩa chọn lọc chứa kháng sinh streptomycin 40 mg/l, spectinomycine 100 mg/l.
Chọn dòng bằng phản ứng PCR:
Chọn 4 khuẩn lạc nuôi qua đêm ở 37ºC trong 4ml LB lỏng có bổ sung kháng sinh Spectinomycine 100mg/l thích hợp để tách chiết plasmid. Sau đó tiến
hành phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu để chọn các dòng khuẩn biến nạp thành công.
2.2.4. Phƣơng pháp chuyển gen vào cây thuốc lá
2.2.4.1. Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào A. tumefaciens
(1) Tế bào khả biến đƣợc đặt trong đá 5 phút, sau đó bổ sung 1 μl vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến và trộn nhẹ.
(2) Rửa cuvette bằng cồn 70° và tráng lại bằng nƣớc khử ion, thấm khô và khử trùng bằng tia UV. Chuyển tất cả hỗn hợp vector tái tổ hợp và tế bào khả biến A. tumefaciens vào cuvette.
(3) Xung điện ở 2,5 kv, 25 μF và điện trở 200 sau đó đặt ngay vào trong đá, sau 5 phút bổ sung 500μl nhẹ.
(4) Chuyển sang ống eppendorf 2 ml. Nuôi lắc ở 28ºC trong 2 giờ.
(5) Chuyển 200μl dịch ra đĩa môi trƣờng LB đặc chứa kháng sinh Rifamycine 50mg/l, Spectinomycine 100 mg/l. Nuôi ở 28°C từ 24 - 48 giờ. Tiến hành colony - PCR chọn lọc các dòng khuẩn thu đƣợc. Cuối cùng điện di trên gel và kiểm tra sản phẩm.
2.2.4.2. Phương pháp tái sinh cây thuốc lá
Quy trình chuyển gen vào giống thuốc lá K326 thông qua vi khuẩn
A.tumefacien CV58 đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp của Topping có cải tiến [47].
Chuyển gen và tái sinh đa chồi: các mảnh lá đƣợc cắt với kích thƣớc khoảng 1cm2
và đặt trên môi trƣờng cảm ứng tái sinh GM (MS + sucrose 30g/l + Agar 8g/l + BAP 1mg/l). Sau hai ngày nuôi trên môi trƣờng GM, mảnh lá sẽ đƣợc ngâm với dịch huyền phù vi khuẩn A.tumefaciens có chứa vector chuyển gen mang gen quan tâm. Sau 30 phút, các mảnh lá sẽ đƣợc thấm khô và đƣợc chuyển lên môi trƣờng GM (AS 200µl/l) trong hai ngày. Sau 2 ngày các mảnh lá tiếp tục đƣợc chuyển lên môi trƣờng GM (BAP 1mg/l) có chứa kháng sinh chọn
lọc kanamycin 50mg/l để tái sinh. Sau 4-5 tuần các cụm chồi hình thành tiếp tục đƣợc cắt chuyển lên môi trƣờng GM (BAP 1mg/l) có kháng sinh cefotaxime
anamycine 50mg/l.
Ra rễ: Sau 4 tuần các chồi phát triển cao khoảng 3cm thì đƣợc cắt và chuyển sang môi trƣờng RM (MS + Sucrose 30g/l+ Agar 7g/l) có bổ sung kháng sinh cefotaxime anamycine 50mg/l.
2.2.4.3. Phương pháp tách DNA từ cây thuốc lá
Quy trình tách DNA tổng số từ lá cây thuốc lá
Cân 200g mẫu lá cây và nghiền trong nitơ lỏng bằng cối, chày sứ cho đến khi thành dạng bột mịn, sau đó cho vào ống eppendorf 2ml.
Bổ sung thêm 700µl dung dịch đệm tách chiết DNA và trộn đều bằng cách đảo nhẹ.
Bảng 2.11: Thành phần dung dịch đệm tách chiết DNA
STT Thành phần Nồng độ
1 Tris- HCl, pH=8,0 0,1M
2 NaCl 1,4M
3 EDTA 0,02M
4 CTAB 4%
Ủ ở nhiệt độ 65°C khoảng 1 giờ (cứ 5 phút đảo nhẹ 1 lần).
Thêm 600µl dung dịch chloroform: isoamyl alcohol (24:1) đảo đều và để 5 phút ở nhiệt độ phòng.
Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 13000v/p ở 4°C, trong 15 phút. Dùng pipet hút lấy 500µl dịch nổi chuyển sang ống eppendorf 1,5ml.
Thêm 500µl isopropanol lạnh, để ở nhiệt độ khoảng -20°C, trong 30 phút. Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 13000v/p ở 4°C, trong 10 phút.