3. Nội dung nghiên cứu
3.1. PHÂN LẬP GEN CYSTATIN2 TỪ GIỐNG NGÔ CÓ KHẢ NĂNG
KHÁNG MỌT SL
3.1.1. Nhân bản gen Cystatin2 (Cys2) từ mRNA bằng kỹ thuật RT-PCR -PCR
Chúng tôi sử dụng bộ kit Trizol Reagents (của hãng Invitrogen) để tách chiết RNA tổng số từ các mẫu lá ngô theo chỉ dẫn của nhà sản xuất, sau đó tổng hợp cDNA bằng phản ứng phiên mã ngƣợc nhờ enzym reverse transcriptase (RT-ase). Sản phẩm cDNA đƣợc sử dụng cho phản ứng PCR để khuếch đại đoạn mã hoá (cDNA) của gen Cys2 với cặp mồi CYS - F/R đƣợc thiết kế dựa trên trình tự gen Cys2 đã công bố trên ngân hàng gen có mã số D38130.
Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose với thang DNA chuẩn 1 kb (Hình 3.1). Kết quả ở Hình 3.1 cho thấy có một băng DNA
400 bp
gen Cys2 38130.
Hình 3.1: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân đoạn mã hóa gen
Cys2, M: Thang chuẩn 1kb, giếng 1-10 Cys2
, thƣớc
, đó có thể là các Nucleotide dƣ thừa 500bp
400bp
sau phản ứng, mồi, enzyme... thu đoạn mã hoá gen Cys2, chúng tôi tiến hành cắt băng DNA mong muốn để tinh sạch. Quá trình tinh sạch đƣợc thực hiện theo quy trình và bộ hóa chất sử dụng của hãng QIAGEN (QIAquick DNA Gel Extraction Kit), kết quả thể hiện ở hình 3.2
Hình 3.2: Hình ảnh điện di sản phẩm tinh sạch đoạn mã hoá của gen Cys2;
M: thang chuẩn 1kb, 1-5 gen Cys2
Kết quả điện di hình 3.2 cho thấy, 1 băng có kích thƣớc khoảng 400bp đúng với kích thƣớc của gen Cys2. Nhƣ vậy có thể kết luận là đã thu đƣợc đoạn DNA có kích thƣớc khoảng 400bp, đảm bảo sử dụng tốt cho phản ứng tiếp theo.
3.1.2. Tách dòng đoạn mã hoá của gen Cys2
Để tạo đƣợc vector tái tổ hợp, chúng tôi thực hiện phản ứng ghép nối (ligation) đoạn gen Cys2 vào vector tách dòng pBT, đây là vector có nhiều ƣu điểm (có kích thƣớc nhỏ; có nhiều điểm cắt của enzyme giới hạn; có chứa gen kháng kháng sinh carbenicillin giúp cho quá trình chọn lọc đơn giản). Thành phần phản ứng ghép nối đoạn gen Cys2 vào vector pBT đã đƣợc mở vòng (Bảng 2.5), phản ứng đƣợc thực hiện trong ống eppendorf 0,5 ml sau đó để trong điều kiện 22°C với thời gian 3 giờ.
Sau đó vector pBT sẽ đƣợc biến nạp vào tế bào E.coli DH5α và đƣợc cấy trải trên môi trƣờng LB đặc có bổ sung kháng sinh carbenicillin 50mg/l, cơ chất X-gal, chất cảm ứng IPTG. Sau đó các tế bào này sẽ đƣợc nuôi ở 37°C trong 16 giờ. Khi này sẽ có các khuẩn lạc xanh và khuẩn lạc trắng mọc đƣợc
400bp 500bp
trên môi trƣờng chọn lọc chứng tỏ chúng đều mang vector pBT. Trong đó khuẩn lạc xanh là các khuẩn lạc mang pBT tự đóng vòng nên chúng vẫn sinh tổng hợp protein β-galactosidase để phân giải cơ chất X-gal từ không màu thành màu xanh. Còn các khuẩn lạc màu trắng do mang vector pBT đã gián đoạn gen lacZ nên không thể phân giải cơ chất thành màu xanh, đây chính là
dòng khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp.
Chọn 5 khuẩn lạc màu trắng trên đĩa thạch chuyển sang nuôi trong LB lỏng (có bổ sung carbenicillin 50mg/l). Nuôi ở 37°C, lắc 200 vòng/phút, trong 16 giờ rồi mang tách plasmid . Sản phẩm tách plasmid đƣợc điện di kiểm tra trên gel agrose 0,8%, kết quả đƣợc thể hiện trên hình 3.3.
Hình 3.3: Hình ảnh điện di tách plasmid tái tổ hợp mang gen Cys2
M: Marker 1kb; 1-5: Plasmid mang gen cystatin2 của giống SL
Kết quả điện di trên hình 3.3 cho thấy sản phẩm tách plasmid tái tổ hợp mang gen Cys2 đạt kết quả tốt, các băng vạch gọn và rõ nét, xuất hiện băng
DNA mong muốn kích thƣớc khoảng 400bp. Các khuẩn lạc đƣợc chòn dòng này phục vụ cho mục đích đọc trình tự.
3.1.3. Kết quả đọc trình tự đoạn mã hoá của gen Cys2
Để xác định trình tự đoạn mã hoá của gen Cys2 chúng tôi tiến hành đọc trình tự 3 mẫu của cùng một plasmid mang gen đích bằng máy đọc trình tự tự động. Kết
500bp 400bp
quả đã xác định đƣợc trình tự gen có kích thƣớc 405 nucleotide mã hoá cho 135 amino acid. Tiến hành so sánh trình tự đoạn mã hoá gen Cys2 của SL với trình tự gen mang mã số D38130 đã công bố trên Ngân hàng gen quốc tế bằng phần mềm BioEdit, kết quả đƣợc trình bày ở hình 3.4.
Hình 3.4: so sánh trình tự đoạn mã hoá gen Cystatin 2
của giống ngô SL và D38130
Kết quả cho thấy kích thƣớc của gen Cys2 ở giống ngô SL và D38130 trên Ngân hàng gen NCBI có kích thƣớc 405 nucleotide. Chúng tôi kết luận đã khuếch đại, tách dòng, giải trình tự nucleotide thành công đoạn gen của giống SL. So sánh trình tự nucleotide của gen Cys2 ở giống ngô SL và D38130 trên
Ngân hàng gen cho thấy, hai trình tự này chỉ khác nhau ở 7 vị trí là 31,100,143,146, 354, 355 và 362. Do vậy trình tự gen Cys2 của giống ngô SL và D38130 có hệ số tƣơng đồng nucleotide là 98,3% (bảng 3.1):
Bảng 3.1: Cys2 ống ngô SL 38130 Vị trí D38130 SL 31 G T 100 G A 143 A G 146 A G 354 G C 355 T C 362 A G
Việc nghiên cứu một gen nào đó, ngoài trình tự nucleotide ngƣời ta còn quan tâm đến trình tự amino acid trong phân tử protein là sản phẩm của gen đó. Trên cơ sở này bằng phần mềm BioEdit chúng tôi đã tiến hành so sánh trình tự amio acid suy diễn từ gen Cys2 của giống ngô SL với D38130 trên Ngân hàng gen kết quả đƣợc trình bày ở hình 3.5.
Hình 3.5: Hình ảnh t protein Cys2
38130
Kết quả so sánh trình tự amino acid ở hình 3.5 cho thấy trình tự amino acid trong protein Cys2 ở giống ngô SL với D38130 có sự khác nhau ở các vị trí là 11,24,34,48,49,113,114 và 121. Sự tƣơng đồng của giống ngô SL so với D38130 về trình tự amino acid là 97,03% (B 3.2).
Bảng 3.2: Sự sai khác giữa trình tự amino acid của giống SL và trình tự có mã số D38130 Vị trí D38130 SL 11 A S 24 N T 34 D N 48 E G 49 N S 113 K N 114 F L 121 E G
Nhƣ vậy, có thể kết luận rằng đã tách dòng thành công và xác định đƣợc trình tự đoạn gen Cys2 phân lập từ ngô có khả năng kháng mọt SL.