3. Nội dung nghiên cứu
2.2.4. Phƣơng pháp chuyển gen vào cây thuốc lá
2.2.4.1. Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào A. tumefaciens
(1) Tế bào khả biến đƣợc đặt trong đá 5 phút, sau đó bổ sung 1 μl vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến và trộn nhẹ.
(2) Rửa cuvette bằng cồn 70° và tráng lại bằng nƣớc khử ion, thấm khô và khử trùng bằng tia UV. Chuyển tất cả hỗn hợp vector tái tổ hợp và tế bào khả biến A. tumefaciens vào cuvette.
(3) Xung điện ở 2,5 kv, 25 μF và điện trở 200 sau đó đặt ngay vào trong đá, sau 5 phút bổ sung 500μl nhẹ.
(4) Chuyển sang ống eppendorf 2 ml. Nuôi lắc ở 28ºC trong 2 giờ.
(5) Chuyển 200μl dịch ra đĩa môi trƣờng LB đặc chứa kháng sinh Rifamycine 50mg/l, Spectinomycine 100 mg/l. Nuôi ở 28°C từ 24 - 48 giờ. Tiến hành colony - PCR chọn lọc các dòng khuẩn thu đƣợc. Cuối cùng điện di trên gel và kiểm tra sản phẩm.
2.2.4.2. Phương pháp tái sinh cây thuốc lá
Quy trình chuyển gen vào giống thuốc lá K326 thông qua vi khuẩn
A.tumefacien CV58 đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp của Topping có cải tiến [47].
Chuyển gen và tái sinh đa chồi: các mảnh lá đƣợc cắt với kích thƣớc khoảng 1cm2
và đặt trên môi trƣờng cảm ứng tái sinh GM (MS + sucrose 30g/l + Agar 8g/l + BAP 1mg/l). Sau hai ngày nuôi trên môi trƣờng GM, mảnh lá sẽ đƣợc ngâm với dịch huyền phù vi khuẩn A.tumefaciens có chứa vector chuyển gen mang gen quan tâm. Sau 30 phút, các mảnh lá sẽ đƣợc thấm khô và đƣợc chuyển lên môi trƣờng GM (AS 200µl/l) trong hai ngày. Sau 2 ngày các mảnh lá tiếp tục đƣợc chuyển lên môi trƣờng GM (BAP 1mg/l) có chứa kháng sinh chọn
lọc kanamycin 50mg/l để tái sinh. Sau 4-5 tuần các cụm chồi hình thành tiếp tục đƣợc cắt chuyển lên môi trƣờng GM (BAP 1mg/l) có kháng sinh cefotaxime
anamycine 50mg/l.
Ra rễ: Sau 4 tuần các chồi phát triển cao khoảng 3cm thì đƣợc cắt và chuyển sang môi trƣờng RM (MS + Sucrose 30g/l+ Agar 7g/l) có bổ sung kháng sinh cefotaxime anamycine 50mg/l.
2.2.4.3. Phương pháp tách DNA từ cây thuốc lá
Quy trình tách DNA tổng số từ lá cây thuốc lá
Cân 200g mẫu lá cây và nghiền trong nitơ lỏng bằng cối, chày sứ cho đến khi thành dạng bột mịn, sau đó cho vào ống eppendorf 2ml.
Bổ sung thêm 700µl dung dịch đệm tách chiết DNA và trộn đều bằng cách đảo nhẹ.
Bảng 2.11: Thành phần dung dịch đệm tách chiết DNA
STT Thành phần Nồng độ
1 Tris- HCl, pH=8,0 0,1M
2 NaCl 1,4M
3 EDTA 0,02M
4 CTAB 4%
Ủ ở nhiệt độ 65°C khoảng 1 giờ (cứ 5 phút đảo nhẹ 1 lần).
Thêm 600µl dung dịch chloroform: isoamyl alcohol (24:1) đảo đều và để 5 phút ở nhiệt độ phòng.
Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 13000v/p ở 4°C, trong 15 phút. Dùng pipet hút lấy 500µl dịch nổi chuyển sang ống eppendorf 1,5ml.
Thêm 500µl isopropanol lạnh, để ở nhiệt độ khoảng -20°C, trong 30 phút. Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 13000v/p ở 4°C, trong 10 phút.
Loại bỏ phần dịch nổi phía trên rửa DNA kết tủa dƣới đáy ống bằng cồn 70% (1 lần). Ly tâm 13000v/p và làm khô DNA kết tủa ở đáy ống eppendorf.
Bổ sung 50µl nƣớc khử ion và 2µl RNAse, ủ ở 37°C trong 30 phút.
PCR kiểm tra sự có mặt của gen biểu hiện:
Chúng tôi tiến hành phản ứng PCR để kiểm tra sự có mặt của gen quan tâm với cặp mồi CYS-F (CACCATGCGCAAACATCGAATCG) và CYS-R (TTAGGCGCTAGCACCCTCTTCA) với thành phần:
Bảng 2.12: Thành phần chạy phản ứng PCR nhân gen Cys2
STT Thành phần Thể tích (µl) 1 H2O 12,5 2 Buffer (10X) 2,5 3 dNTP(25mM) 2.5 4 Mg2+(25mM) 2.5 5 CYS-F(10pM/µl) 1 6 CYS-R (10pM/µl) 1 7 Taq polymerasa 1 8 DNA 2 Tổng thể tích 25
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. PHÂN LẬP GEN CYSTATIN2 TỪ GIỐNG NGÔ CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG MỌT SL KHÁNG MỌT SL
3.1.1. Nhân bản gen Cystatin2 (Cys2) từ mRNA bằng kỹ thuật RT-PCR -PCR
Chúng tôi sử dụng bộ kit Trizol Reagents (của hãng Invitrogen) để tách chiết RNA tổng số từ các mẫu lá ngô theo chỉ dẫn của nhà sản xuất, sau đó tổng hợp cDNA bằng phản ứng phiên mã ngƣợc nhờ enzym reverse transcriptase (RT-ase). Sản phẩm cDNA đƣợc sử dụng cho phản ứng PCR để khuếch đại đoạn mã hoá (cDNA) của gen Cys2 với cặp mồi CYS - F/R đƣợc thiết kế dựa trên trình tự gen Cys2 đã công bố trên ngân hàng gen có mã số D38130.
Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose với thang DNA chuẩn 1 kb (Hình 3.1). Kết quả ở Hình 3.1 cho thấy có một băng DNA
400 bp
gen Cys2 38130.
Hình 3.1: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân đoạn mã hóa gen
Cys2, M: Thang chuẩn 1kb, giếng 1-10 Cys2
, thƣớc
, đó có thể là các Nucleotide dƣ thừa 500bp
400bp
sau phản ứng, mồi, enzyme... thu đoạn mã hoá gen Cys2, chúng tôi tiến hành cắt băng DNA mong muốn để tinh sạch. Quá trình tinh sạch đƣợc thực hiện theo quy trình và bộ hóa chất sử dụng của hãng QIAGEN (QIAquick DNA Gel Extraction Kit), kết quả thể hiện ở hình 3.2
Hình 3.2: Hình ảnh điện di sản phẩm tinh sạch đoạn mã hoá của gen Cys2;
M: thang chuẩn 1kb, 1-5 gen Cys2
Kết quả điện di hình 3.2 cho thấy, 1 băng có kích thƣớc khoảng 400bp đúng với kích thƣớc của gen Cys2. Nhƣ vậy có thể kết luận là đã thu đƣợc đoạn DNA có kích thƣớc khoảng 400bp, đảm bảo sử dụng tốt cho phản ứng tiếp theo.
3.1.2. Tách dòng đoạn mã hoá của gen Cys2
Để tạo đƣợc vector tái tổ hợp, chúng tôi thực hiện phản ứng ghép nối (ligation) đoạn gen Cys2 vào vector tách dòng pBT, đây là vector có nhiều ƣu điểm (có kích thƣớc nhỏ; có nhiều điểm cắt của enzyme giới hạn; có chứa gen kháng kháng sinh carbenicillin giúp cho quá trình chọn lọc đơn giản). Thành phần phản ứng ghép nối đoạn gen Cys2 vào vector pBT đã đƣợc mở vòng (Bảng 2.5), phản ứng đƣợc thực hiện trong ống eppendorf 0,5 ml sau đó để trong điều kiện 22°C với thời gian 3 giờ.
Sau đó vector pBT sẽ đƣợc biến nạp vào tế bào E.coli DH5α và đƣợc cấy trải trên môi trƣờng LB đặc có bổ sung kháng sinh carbenicillin 50mg/l, cơ chất X-gal, chất cảm ứng IPTG. Sau đó các tế bào này sẽ đƣợc nuôi ở 37°C trong 16 giờ. Khi này sẽ có các khuẩn lạc xanh và khuẩn lạc trắng mọc đƣợc
400bp 500bp
trên môi trƣờng chọn lọc chứng tỏ chúng đều mang vector pBT. Trong đó khuẩn lạc xanh là các khuẩn lạc mang pBT tự đóng vòng nên chúng vẫn sinh tổng hợp protein β-galactosidase để phân giải cơ chất X-gal từ không màu thành màu xanh. Còn các khuẩn lạc màu trắng do mang vector pBT đã gián đoạn gen lacZ nên không thể phân giải cơ chất thành màu xanh, đây chính là
dòng khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp.
Chọn 5 khuẩn lạc màu trắng trên đĩa thạch chuyển sang nuôi trong LB lỏng (có bổ sung carbenicillin 50mg/l). Nuôi ở 37°C, lắc 200 vòng/phút, trong 16 giờ rồi mang tách plasmid . Sản phẩm tách plasmid đƣợc điện di kiểm tra trên gel agrose 0,8%, kết quả đƣợc thể hiện trên hình 3.3.
Hình 3.3: Hình ảnh điện di tách plasmid tái tổ hợp mang gen Cys2
M: Marker 1kb; 1-5: Plasmid mang gen cystatin2 của giống SL
Kết quả điện di trên hình 3.3 cho thấy sản phẩm tách plasmid tái tổ hợp mang gen Cys2 đạt kết quả tốt, các băng vạch gọn và rõ nét, xuất hiện băng
DNA mong muốn kích thƣớc khoảng 400bp. Các khuẩn lạc đƣợc chòn dòng này phục vụ cho mục đích đọc trình tự.
3.1.3. Kết quả đọc trình tự đoạn mã hoá của gen Cys2
Để xác định trình tự đoạn mã hoá của gen Cys2 chúng tôi tiến hành đọc trình tự 3 mẫu của cùng một plasmid mang gen đích bằng máy đọc trình tự tự động. Kết
500bp 400bp
quả đã xác định đƣợc trình tự gen có kích thƣớc 405 nucleotide mã hoá cho 135 amino acid. Tiến hành so sánh trình tự đoạn mã hoá gen Cys2 của SL với trình tự gen mang mã số D38130 đã công bố trên Ngân hàng gen quốc tế bằng phần mềm BioEdit, kết quả đƣợc trình bày ở hình 3.4.
Hình 3.4: so sánh trình tự đoạn mã hoá gen Cystatin 2
của giống ngô SL và D38130
Kết quả cho thấy kích thƣớc của gen Cys2 ở giống ngô SL và D38130 trên Ngân hàng gen NCBI có kích thƣớc 405 nucleotide. Chúng tôi kết luận đã khuếch đại, tách dòng, giải trình tự nucleotide thành công đoạn gen của giống SL. So sánh trình tự nucleotide của gen Cys2 ở giống ngô SL và D38130 trên
Ngân hàng gen cho thấy, hai trình tự này chỉ khác nhau ở 7 vị trí là 31,100,143,146, 354, 355 và 362. Do vậy trình tự gen Cys2 của giống ngô SL và D38130 có hệ số tƣơng đồng nucleotide là 98,3% (bảng 3.1):
Bảng 3.1: Cys2 ống ngô SL 38130 Vị trí D38130 SL 31 G T 100 G A 143 A G 146 A G 354 G C 355 T C 362 A G
Việc nghiên cứu một gen nào đó, ngoài trình tự nucleotide ngƣời ta còn quan tâm đến trình tự amino acid trong phân tử protein là sản phẩm của gen đó. Trên cơ sở này bằng phần mềm BioEdit chúng tôi đã tiến hành so sánh trình tự amio acid suy diễn từ gen Cys2 của giống ngô SL với D38130 trên Ngân hàng gen kết quả đƣợc trình bày ở hình 3.5.
Hình 3.5: Hình ảnh t protein Cys2
38130
Kết quả so sánh trình tự amino acid ở hình 3.5 cho thấy trình tự amino acid trong protein Cys2 ở giống ngô SL với D38130 có sự khác nhau ở các vị trí là 11,24,34,48,49,113,114 và 121. Sự tƣơng đồng của giống ngô SL so với D38130 về trình tự amino acid là 97,03% (B 3.2).
Bảng 3.2: Sự sai khác giữa trình tự amino acid của giống SL và trình tự có mã số D38130 Vị trí D38130 SL 11 A S 24 N T 34 D N 48 E G 49 N S 113 K N 114 F L 121 E G
Nhƣ vậy, có thể kết luận rằng đã tách dòng thành công và xác định đƣợc trình tự đoạn gen Cys2 phân lập từ ngô có khả năng kháng mọt SL.
3.2. KẾT QUẢ THIẾT KẾ VECTOR MANG CẤU TRÚC GEN Cys2
3.2.1. Tạo vector tái tổ hợp pENTRTM
/D-TOPO®
Sản phẩm PCR Cys2 nhân từ plasmid đƣợc gắn vào vector pENTR™/D- TOPO® theo bộ Kit pENTR™/D-TOPO® tạo plasmid tái tổ hợp có mang gen
Cys2. Dựa vào sự hình thành mối liên kết hydro giữa 4 nucleotide CACC đầu
5’của sản phẩm PCR, với 4 nucleotide GTGG đầu 3’ trên vector và nhờ enzyme topoisomerase (TOPO) ở trên vector nối các đầu của sản phẩm PCR vào vector mà plasmid tái tổ hợp pENTR™/D-TOPO®
có gắn các đoạn gen quan tâm đƣợc tạo thành (Thành phần phản ứng đƣợc trình bày ở Bảng 2.8).
Vector pENTRTM/D-TOPO®là vector đầu vào cho phản ứng lai LR trong kỹ thuật Gateway có kích thƣớc 2580bp, trên vector có hai vị trí attL1 và attL2, đoạn gen cần chuyển sẽ đƣợc gắn vào giữa hai vị trí này.
Sản phẩm gắn pENTR™/D-TOPO®
đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli
plasmid với số lƣợng lớn. Kết quả thể hiện ở sản phẩm biến nạp thành công plasmid tái tổ hợp có mang gen Cys2 vào vi khuẩn E. coli One Shop® Top 10 thu đƣợc một lƣợng lớn các khuẩn lạc trắng.
Để kiểm tra đoạn gen mong muốn đã đƣợc chuyển vào vector nhân dòng pENTRTM/D-TOPO®, tiến hành lựa chọn một dòng khuẩn lạc dƣơng tính với phản ứng colony-PCR nuôi để cất giữ trong tủ lạnh ở -84°C và tách chiết plasmid. Sản phẩm tách plasmid có nồng độ xấp xỉ 2690 ng/ μl và kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR tách chiết plasmid cho thấy, chúng tôi đã thu đƣợc đoạn gen có kích thƣớc 400bp phù hợp với tính toán theo lý thuyết. Điều này chứng tỏ đoạn gen Cys2 đã đƣợc nhân dòng, ghép nối thành công tạo vector tái tổ hợp pENTR -Cys2 (Hình 3.6).
Hình 3.6:
-Cys: M: Market 1kb, 1: Sản phẩm PCR từ plasmid tái tổ hợp
3.2.2. Tạo vector chuyển gen mang cấu trúc Cys2 bằng kỹ thuật Gateway
Cys2
p -
- Cys2
500bp
-
Cys2 (pPhaso- Cys2). Sản phẩm của phản ứng LR là một
vector tái tổ hợp đƣợc kí hiệu là pPhaso-Cys2. Để thu đƣợc dòng plasmid pPhaso-Cys2 thì hỗn hợp phản ứng LR phải đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến
E.coli DH5α. Sản phẩm của quá trì nuôi trên môi trƣờng chọn lọc có chứa kháng sinh spectinomycine 100mg/l. Tuy nhiên để xác định chính xác các plasmid tái tổ hợp mới đƣợc tạo thành đúng nhƣ mong đợi, chúng tôi đã sử dụng phản ứng PCR với cặp mồi CYS-F/R để kiểm tra.
Kết quả kiểm tra plamis tái tổ hợp bằng PCR cho thấy sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân gen Cys2 có kích thƣớc khoảng 400bp. Các kích thƣớc này hoàn toàn phù hợp với tính toán theo lí thuyết (Hình 3.7)
Hình 3.7: Hình ảnh điện di kiểm tra plasmid tái tổ hợp pPhaso-Cys2
1,2,3,4: plasmid; 6,7,8,9: Sản phẩm PCR plasmid ; M: Marker 1kb
Nhƣ vậy qua kết quả của phản ứng PCR 2 dòng khuẩn lạc 1,4 chứa vector chuyển gen pPhaso- Cys2 hay nói cách khác cấu trúc gen Cys đã đƣợc thiết kế thành công vào vector biểu hiện ở hạt.
Cys2 400bp. Từ kết quả trên chúng tôi đã lựa chọn dòng plasmid số 1 sử dụng cho biến nạp vào vi khuẩn A. tumefaciens.
500bp
3.2.3. Kết quả tạo dòng vi khuẩn A. tumefaciens tái tổ hợp
Để Agrobacterium
tumefaciens - Cys2
n . tổ hợp pPhaso-Cys2 đã đƣợc biến nạp vào vi khuẩn A.
tumefaciens bằng xung điện 2,5kv. Đây là
phƣơng pháp biến nạp có hiệu quả cao đồng thời rút ngắn đƣợc thời gian thí nghiệm. Sản phẩm sau khi biến nạp đƣợc cấy trải trên các đĩa chọn lọc có chứa các kháng sinh spectinomycine100 mg/l và rifamycine 50 mg/l.
Hình 3.8 A.tumefaciens
Kết quả của quá trình biến nạp đã thu đƣợc các khuẩn lạc màu trắng (Hình 3.8). Tuy nhiên, để khẳng định chắc chắn vector đã đƣợc biến nạp thành công chúng tôi tiến hành tách chiết plasmid và thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân gen Cys2.
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8% với cặp mồi đặc hiệu CYS-F/CYS-R trên hình 3.9 cho thấy 3 dòng khuẩn lạc đƣợc lựa chọn cho kết quả dƣơng tính với phản ứng PCR với một băng duy nhất có kích thƣớc
6,7,8. Điều này đã chứng tỏ kết quả biến nạp thành công vector pPhaso-Cys2 vào tế bào A.tumefaciens và nhƣ vậy chúng tôi đã tạo đƣợc chủng A.tumefaciens mang plasmid tái tổ hợp pPhaso-Cys2.
Hình 3.9: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR trong chủng vi khuẩn A. tumefaciens CV58: M: Marker 1kb; 1-5: Sản phẩm plasmid ; 6-10 Sản phẩm PCR nhân gen Cys2
Chủng A. tumefaciens tái tổ hợp mang cấu trúc pPhaso-Cys2 đƣợc sử dụng để lây nhiễm vào mô đã gây tổn thƣơng phục vụ cho mục đích chuyển gen vào cây trồng.
3.3. TẠO CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC GEN pPhaso-Cys2 pPhaso-Cys2
Tái sinh cây thuốc lá phục vụ chuyển gen là kỹ thuật tƣơng đối đơn giản và thời gian phân hóa từ mô đến cây hoàn chỉnh khá ngắn, nên trong những nghiên cứu về chuyển gen các nhà khoa học thƣờng chọn cây thuốc lá là cây mô hình. Vì vậy, những nghiên cứu về chuyển gen trên cây thuốc lá đã đƣợc tiến hành từ khá sớm nhằm mục đích đánh giá hoạt động của vector chuyển gen thông qua sự có mặt và biểu hiện của gen chuyển.
Chúng tôi đã tiến hành chuyển cấu trúc vector pPhaso- Cys2 mang gen Cys2 vào cây thuốc lá theo quy trình tái sinh đƣợc thể hiện ở hình 3.10. Đ
khuẩn lạc A. tumefaciens sau khi đƣợc khẳng định mang gen đích đã đƣợc nuôi trong môi trƣờng LB lỏng đến mật độ khuẩn đo đƣợc OD = 0,8-1,0 đem biến nạp vào cây thuốc lá Nicotiana tabacum K326 đã
đƣợc cắt tổn thƣơng 4 cạnh và nuôi cấy trên môi trƣờng cảm ứng GM trƣớc 2 ngày (Hình 3.10 A).
A B C
E D
Hình 3.10: Hình ảnh giai đoạn chuyển gen vào cây thuốc lá
A: Mảnh lá sau khi nhiễm khuẩn được cấy trên môi trường GM B: Mảnh lá được chuyển sang môi trường GM có bổ sung cefotaxime 400 mg/l, kanamycine 50 mg/l. C: Các cụm chồi được tạo thành sau hai tuần nuôi cấy trên