3. Nội dung nghiên cứu
1.4.1. Phƣơng pháp chuyển gen vào thực vật thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens
Hiện nay, có nhiều phƣơng pháp chuyển gen đƣợc các nhà khoa học sử dụng để chuyển gen vào thực vật nhƣ: phƣơng pháp gián tiếp sử dụng
Agrobacterium tumefaciens, phƣơng pháp trực tiếp sử dụng xung điện, vi tiêm,
xử lý polyethylene glycol (PEG) và dùng súng bắn gen. Mỗi phƣơng pháp chuyển gen đều có những ƣu, nhƣợc điểm riêng tùy vào từng loài cây khác nhau. Trong đó phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn A. tumefaciens đem lại hiệu quả cao và ít tốn kém nhất.
Năm 1980, lần đầu tiên DNA ngoại lai (transposon Tn7) đƣợc chuyển vào thực vật nhờ A. tumefaciens, tuy nhiên T-DNA vẫn chƣa đƣợc thay đổi.
Năm 1983, nhiều nhóm nghiên cứu đã biến đổi T-DNA và đƣa DNA ngoại lai vào, tạo ra tính kháng một số chất kháng sinh. Ngoài ra, các gen tạo khối u đƣợc cắt ra. DNA ngoại lai cùng với phần còn lại đƣợc chuyển vào thực vật và đƣợc biến nạp. Thành công này nhờ nghiên cứu chính xác con đƣờng lây nhiễm của A. tumefaciens trƣớc đó và khả năng của hệ thống chọn
lọc đối với thực vật.
Phƣơng pháp chuyển gen vào thực vật thông qua vi khuẩn A.tumefaciens
ban đầu không đƣợc xem là có hiệu quả với cây một lá mầm. Tuy nhiên, đã có nhiều cố gắng trong việc cải tiến khả năng tái sinh đối với các cây một lá
mầm, những callus lây nhiễm với A.tumefaciens đƣợc sinh ra từ mô rễ [24]
và phôi chƣa trƣởng thành [25] đã đƣợc sử dụng.
Chuyển gen vào cây một lá mầm thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens là bƣớc đột phá của công nghệ gen. Đây là kỹ thuật chuyển gen
đƣợc ƣa chuộng nhất vì có nhiều ƣu điểm so với chuyển gen bằng phƣơng pháp bắn gen, nhƣ cho nhiều sự kiện chuyển gen ổn định, ít bản sao, thể hiện đúng, tăng tần số đồng biểu hiện và ít có sự tái sắp xếp gen chuyển nạp. Đến nay, các quy trình chuyển gen hiệu quả đã đƣợc xây dựng cho các cây một lá mầm nhƣ lúa [24], [30], lúa mì [26]. Chuyển gen vào phôi non ngô dòng A188 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens [30]. Năm 2002, Frame và cs đã chuyển
gen vào phôi non dòng ngô Hi II [28].
Cây chuyển gen đầu tiên đã đƣợc tạo ra năm 1983 vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens. Đây là loại vi khuẩn sống trong đất, gây bệnh cho
cây bằng cách gắn các đoạn gen vào hệ gen của tế bào chủ và sinh ra u nhờ một loại plasmid Ti. Phần lớn các loại Ti-plasmid gồm 4 vùng A, B, C, D.
Vùng A luôn luôn đƣợc truyền sang tế bào thực vật nên đƣợc gọi là T- DNA. Vùng B có liên quan đến sự tái sinh. Vùng C có liên quan đến sự tiếp hợp. Vùng D là vùng độc có chứa các gen vir, giữ vai trò quan trong trong việc chuyển T-DNA vào hệ gen nhân của tế bào thực vật.
Điều kiện cho việc chuyển T-DNA vào thực vật trƣớc hết là tế bào bị tổn thƣơng. Khi tế bào bị tổn thƣơng, chúng tiết ra các hợp chất phenol (acetosyringon), chất có vai trò quan trọng trong việc nhận biết và sự gắn kết giữa vi khuẩn và tế bào thực vật. A.tumefaciens nhận biết acetosyringon nhờ một chất nhận, đƣợc mã hóa bằng một gen ở vùng vir. Sự nhận biết của chất nhận
dẫn đến sự hoạt hóa của tất cả các gen vir.
Có hai hệ thống vector dùng cho chuyển gen thông qua A. tumefaciens là
Vector liên hợp (cointegrate)
Vì kích thƣớc Ti plasmid quá lớn nên thao tác với chúng rất khó khăn. Giải pháp cho việc này là chuyển vùng T - DNA lên một vector nhỏ hơn. Điều này là hoàn toàn có thể nhờ gen vir đóng vai trò vận chuyển gen vào tế bào chủ. Hệ thống này gọi là hệ thống vector liên hợp. Cả gen tiền ung thƣ và gen tổng hợp opine ở dạng T - DNA hoang dại đều đƣợc thay thế bởi gen chọn lọc (gen kháng kháng sinh). Gen sinh tổng hợp opine trên Ti plasmid cũng bị loại bỏ và chỉ giữ lại gen vir cần thiết cho việc hình thành bộ máy và cấu trúc đảm bảo cho việc sao chép bền vững của plasmid trong A.tumefaciens [10], [17].
Vector nhị thể (binary vector)
Vector nhị thể bao gồm hai vector (một là plasmid tách dòng từ E.coli
trong đó có thiết kế vùng bờ trái và bờ phải, nằm giữa chúng là các gen chỉ thị và vùng gắn gen cần chuyển; plasmid thứ hai là Ti-plasmid cải tiến: toàn bộ vùng T-DNA và vùng bờ trái và bờ phải bị cắt bỏ chỉ giữ lại vùng vir, plasmid này đƣợc gọi là plasmid hỗ trợ). Hệ thống vector này cũng hoạt động theo cơ chế chuyển gen của vi khuẩn đất A.tumefaciens một cách rất hữu hiệu. Khắc
phục tình trạng khó nhân bản trong A.tumefaciens, loại vector nhị thể đƣợc thiết kế bao gồm các phần nhƣ sau:
i) Vị trí ghép nối đa điểm;
ii) Đoạn khởi đầu tái bản hoạt động cả ở E. coli và A.tumefaciens; iii) Gen chọn lọc hoạt động đƣợc ở cả vi khuẩn và thực vật;
iv) gen có khả năng vận chuyển (nhƣ oriV, oriT, trfA), chỉ cần khi chuyển gen thông qua A. tumefaciens, không cần khi chuyển gen trực tiếp;
v) Đoạn T - DNA ngoại biên (border), đặc biệt là đoạn ngoại biên phải bắt buộc phải có. Ngoài ra còn một số thành phần phụ trợ khác nhƣ đoạn kích thích vận chuyển T - DNA.
Hệ vector nhị thể đƣợc thiết kế bao gồm hai plasmid tự tái bản. Loại vector vận tải mang đoạn gen quan tâm (gen of interest = GOI) giữa đoạn ngoại biên của T - DNA và một plasmid hỗ trợ có gen vir đảm nhiệm chức năng vận
chuyển vào tế bào thực vật. Plasmid hỗ trợ đƣợc cải biến từ các Ti plasmid bình thƣờng bằng cách loại bỏ gen kích thích tế bào thực vật phát triển thành khối nhƣng vẫn duy trì khả năng thâm nhập vào tế bào thực vật [10], [17].
1.4.2.
Đối với cây ngô, trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens vào mô sẹo dạng I từ đoạn cây con [44], phôi non [28], [29], [32], [49], [50], phôi non và phôi từ mô sẹo [40]. Phôi ngô đƣợc sử dụng nhiều và cho hiệu quả chuyển nạp gen khá cao. Nghiên cứu chuyển gen thành công vào phôi non các dòng ngô A634, H99, W117 sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens với tỷ lệ thành công khoảng 15%, riêng dòng A188 cho tỷ lệ cao nhất 50% [32]. Wang và cs (2007) cũng chuyển vector pCABIA3301
mang gen glgC vào phôi non của dòng ngô Zong3, sau 3 thế hệ cho thấy hàm
lƣợng tinh bột trong hạt đã tăng từ 13 đến 25% [50]. Vega và cs (2008) đã chuyển thành công vector pCABIA3301 và pZY101 vào phôi non dòng ngô Hi-II sử dụng vi khuẩn A.tumefaciens, tỷ lệ chuyển gen thành công trong nghiên cứu này vào khoảng 12%, cao nhất có dòng đạt đƣợc 18% [49]. Li và cs (2010) đã nghiên cứu chuyển gen Bt2 và Sh2 vào mô phân sinh cây ngô non của dòng ngô DH4866 sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens đã đem lại hiệu quả khá cao, khoảng 10% các cây non xử lý đƣợc chuyển gen [36]. Năm 2012, Wang và cs đã sử dụng mô phân sinh chồi của hai dòng ngô cận giao Tian Tawu và 7922 để chuyển gen mã hóa phytoene synthase (psy) thông qua A. tumefsciens [51].
Phƣơng pháp này làm giảm thời gian trong nuôi cấy mô truyền thống và đã chứng tỏ đây là phƣơng pháp chuyển gen đơn giản.
Năm 2009, Kim và cs đã sử dụng phƣơng pháp chuyển gen thông qua A. tumefaciens vào phôi non để tạo cây ngô chuyển gen kháng chất điệt cỏ [34].
Với việc áp dụng kĩ thuật chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens, Trƣơng Thu Hằng đã chọn tạo thành công dòng ngô HR9 có mang
gen kháng sâu CryIAc. Khi phân tích biểu hiện của gen kháng sâu (CryIAc) ở
thế hệ T1, đã chỉ ra rằng trong số hơn 1500 cá thể thuộc 10 dòng HR9 thế hệ T0 mang gen CryIAc có khoảng hơn 100 cá thể thuộc 10 dòng T0 nói trên mang gen kháng sâu đục thân cao [5].
Takava và cs (2010) đã chuyển vector pCABIA3301 vào 4 dòng ngô thuần S61, B73, Mo17, A188 và 2 dòng ngô lai HiIIB và HiIIC thông qua vi khuẩn A. tumefaciens LBA4404. Các tác giả đã lấy phôi có kích thƣớc trung bình từ 1,5
đến 2 mm đồng nuôi cấy với vi khuẩn A. tumefaciens LBA4404 trong 72 giờ (3 ngày) và sử dụng MES, timentin và PPT để diệt và chọn lọc mẫu đƣợc gây nhiễm, tạo callus và tái sinh cây. Hai dòng S61 và A188 cho kết quả tái sinh cao nhất. PCR để phát hiện gen gus và bar trong hệ gen của cây tái sinh. Tần số xuất hiện hai gen này là 6,45% đối với dòng S61 [45].
Năm 2010, Anima và cs cũng chuyển hai vector pXBb7-SI-UBIL và pBbm42GW7_GUS vào phôi non của 3 dòng ngô TL26, CML216 và CML244 với môi trƣờng đồng nuôi cấy có nồng độ cao hơn các nghiên cứu khác (200 µM acetosyringone) và cũng tạo ra đƣợc cây chuyển và và đời con lai của các dòng chuyển gen trên [20].
Ở Việt Nam hiện nay đã sử dụng rộng rãi phƣơng pháp biến nạp gen vào vi khuẩn A. tumefaciens để chuyển vào cây trồng rất nhiều và đem lại các thành tựu đáng kể nhƣ: đã chuyển đƣợc gen cryIA kháng sâu xanh Heliothis armigera vào cây hông và cây cải ngọt thông qua vi khuẩn A. tumefacien EHA 105 [2] đã chuyển đƣợc gen kháng thuốc diệt cỏ và kháng côn trùng chích hút vào cây thuốc lá nhờ vi khuẩn A.tumefacien LBA 4404 [3].
Các nghiên cứu về chuyển gen ngô nhờ vi khuẩn A.tumefaciens đã đƣợc thực hiện chủ yếu với mục đích kháng sâu bệnh và thuốc trừ cỏ. Theo báo cáo khoa học của Viện Di truyền nông nghiệp đã tạo đƣợc 6 dòng ngô GA35 mang
gen nptII bằng phƣơng pháp chuyển gen thông qua A.tumefaciens [4]. Chƣa có kết quả nghiên cứu nào về việc sử dụng kỹ thuật gen làm tăng năng suất ngô thông qua tăng chất lƣợng cũng nhƣ trữ lƣợng tinh bột. Phạm Thị Lý Thu (2007) đã nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh từ phôi non và xác định phƣơng pháp chuyển gen thích hợp ở ngô ở hai dòng ngô HR8 và HR9, tác giả nhận định rằng chuyển gen bằng súng bắn gen có hiệu quả cao nhất đối với hai dòng ngô nghiên cứu [14].
Đinh Văn Trình và cs sử dụng A.tumefaciens EHA105 chứa vector pBiG.ubi mang gen chịu hạn - ZmDREB2A và gen kháng hygromycin hpt.
Nhóm tác giả sử dụng râu ngô đã đƣợc cách ly tiếp xúc với dịch huyền phù vi khuẩn trƣớc khi thụ phấn của cùng dòng. 135 bắp (13145 hạt thế hệ đầu tiên T0) đã thu đƣợc trong vụ đông xuân năm 2006 - 2007. Cây con chuyển gen giai đoạn 2 -3 lá đƣợc sàng lọc bằng điều kiện khô hạn. Phép thử tính kháng hygromycin và phân tích PCR trên 59 cây T0 sau xử lý hạn cho thấy hiệu quả chuyển gen ở thế hệ T0 đạt 0,023% [16].
Chƣơng 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ
2.1.1. Vật liệu
Nguyên liệu thực vật
Sử dụng hạt của giống ngô có khả năng kháng mọt cao thu thập tại tỉnh Sơn La. Hạt có hình răng ngựa, màu tím, đƣờng kính hạt 0,5-1mm.
Hình 2.1: Ảnh của giống ngô SL
Giống thuốc lá Nicotiana tabacum K326 do phòng Công nghệ tế
vật, phòng thí nghiệm trọng điểm quốc gia về công nghệ gen, Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam cung cấp.
Các vector và chủng vi khuẩn sử dụng
Vector pBT; vector pPhasonin, pENTRTM/D-TOPO® do phòng Công nghệ ADN và ứng dụng, Viện Công nghệ Sinh học- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam cung cấp.
Chủng vi khuẩn E.coli DH5α và A. tumefaciens CV58, do phòng Công ng vật của Viện Công nghệ Sinh học cung cấp.
Cặp mồi: CYS-F/R đƣợc thiết kế dựa trên sự phân tích trình tự gen
Bảng 2.1: Trình tự cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu
Mồi Trình tự Tm (ºC) % GC
CYS-F 5’- CAC CAT GCG CAA ACA TCG AAT CG -3’ 64,7 52,2 CYS-R 5’- TTA GGC GCT AGC ACC CTC TTC A -3’ 64 54,5
2.1.2. Hoá chất và thiết bị
Hóa chất
Trizol Reagents Kit (của hãng Invitrogen) để tách chiết RNA; Plasmid Extraction Kit (của hãng Bioneer, Hàn Quốc), nƣớc khử ion, ampicillin, X-gal, agarose của hãng Merck, Amersham Pharmacia Biotech. Thang chuẩn 1kb của hãng Guangzhou Geneshun Biotech Ltd.
Các loại kháng sinh: kanamycine 50mg/l, rifamycin3 50mg/l, spectinomycine 100mg/l, cefotaxime 400mg/l, Carbenicillin 50mg/l.
Môi trƣờng nuôi cấy: LB (đặc, lỏng), MS đặc, MS lỏng không đƣờng, GM, RM. Các chất điều tiết sinh trƣởng: BAP.
Thiết bị
Bộ nguồn điện di PowerPac 300 (Bio-Rad, Hoa Kỳ), máy PCR System 9700 (Applied Biosytem Mỹ), máy li tâm lạnh Hittich (Đức), lò vi sóng (SamSung, Hàn Quốc), tủ sấy của hãng Carbolite (Anh), tủ lạnh -20°C(Sanyo, Nhật Bản), tủ lạnh -800
C (Super Freezer Eco130 - Ficchetti - Ý), máy đo quang phổ định lƣợng (nanoDrop Lite Spectophotometer - Mỹ), bể ổn nhiệt (BW- 0,5G Jeiotech - Hàn Quốc), pipetman, giá đổ điện di, cối chày sứ, bể ổn nhiệt, nồi khử trùng, máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thụy Điển), máy vortex (Mimeshaker, IKA, Đức), máy hút chân không Speed -Vac 110A (Savant, Mỹ), máy sung điện Gen Plulser. Đây là các thiết bị của phòng Công nghệ tế bào thực vật, phòng công nghệ DNA và ứng dụng, Viện Công nghệ Sinh học- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam cung cấp.
2.1.3. Địa điểm nghiên cứu
Đề tài luận văn đƣợc hoàn thành tại khoa Khoa học Sự Sống, Trƣờng Đại học Khoa Học - Đại học Thái Nguyên. Các thí nghiệm của đề tài đƣợc thực hiện tại phòng Công ngh vật, phòng thí nghiệm trọng điểm quốc gia về công nghệ gen, ADN và , Viện Công nghệ Sinh học- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Phân lập gen 2.2.1. Phân lập gen
2.2.1.1. Phương pháp tách chiết RNA
Phƣơng pháp tách chiết RNA tổng số: Sử dụng bộ kit Trizol Reagents (Hãng Invitrogen) để tách chiết RNA tổng số từ các lá mầm của ngô theo chỉ dẫn của nhà sản xuất gồm các bƣớc:
Nghiền nhanh 100mg mẫu trong nitơ lỏng.
Thêm 1ml Trizone Regents, đảo nhẹ đều trong 5 phút.
Thêm 200µl chloroform/isoamyl alcohol (24:1), đảo đều ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
Ly tâm 10000 vòng trong 15 phút ở 4ºC.
Thu 500 µl dịch nổi sang ống eppendoft 1,5ml.
Thêm 500 µl Isopropanol lạnh, đảo đều 15 phút ở nhiệt độ phòng (hoặc để ở -20ºC trong 30 phút).
Ly tâm 10000 vòng trong 15 phút ở 4ºC, thu tủa.
Thêm 700 µl cồn lạnh 70% (pha bằng dH2O + 0,01% DEPC). Ly tâm 6000 vòng trong 5 phút ở 4ºC. Lặp lại 2 lần.
Làm khô RNA trong box.
Kiểm tra sản phẩm RNA tổng số tách chiết đƣợc bằng điện di trên gel agarose 0,8% và đo bằng máy NanoDrop (Lite Spectophotometer).
2.2.1.2. Phương pháp tổng hợp cDNA
Bảng 2.2: Thành phần cho phản ứng tổng hợp cDNA
STT Thành phần Thể tích ( µl)
1 RNA tổng số (10-20 ng/μl) 5
2 Priemere random hexamine (250ng) 1
3 DEPC Water 6
Tổng thể tích 12
Ủ ở 65°C trong 5 phút, sau đó cho ngay vào đá lạnh trong 5 phút.
Bổ sung các thành phần sau: Reaction Buffer (5X) 4µl; dNTP (10mM) 2µl; Ribolock Rnase Inhibitor (20u/µl) 1µl; RevertAid H Minus Reverse Transcriptase (200u/ µl) 1 µl.
Ủ trong máy PCR ở các mức nhiệt độ sau: Ủ 25°C trong 5 phút – 42°C trong 60 phút- 70°C trong 5 phút, bƣớc cuối ủ ở 4°C.
2.2.1.3. Phương pháp PCR
cDNA của gen Cystatin đƣợc khuếch đại bằng kĩ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu theo thành phần phản ứng và chu trình nhiệt nhƣ sau:
Bảng 2.3: Thành phần của phản ứng PCR nhân gen Cystatin
STT Thành phần Nồng độ
1 Nƣớc khử ion 12,5 µl
2 Đệm PCR 10X 2,5 µl
3 MgCl2 (25mM) 2,5 µl
4 dNTPs (25mM) 2,5 µl
5 Mồi xuôi (10pmol/µl) 1 µl
6 Mồi ngƣợc (10pmol/µl) 1 µl
7 Taq DNA polymerase (5 đơn vị/ µl) 1 µl
8 cDNA khuôn (10-20 ng/µl) 2 µl
Bảng 2.4: Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR nhân gen Cystatin
Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ ( ºC) Thời gian Chu kì
1 Biến tính 95 4 phút 1
2 Biến tính 95 30 giây
35
3 Gắn mồi 58 30 giây
4 Kéo dài chuỗi 72 30 giây
5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1
6 Kết thúc phản ứng 4 ∞
2.2.1.4. Phương pháp thôi gel
Quá trình thôi gel, tinh sạch đƣợc thực hiện theo quy trình và bộ hóa chất sử dụng cho tinh sạch của hãng QIAGEN (QIAquick DNA Gel Extraction Kit), gồm các bƣớc sau:
- Thêm buding buffer và sản phẩm PCR tỉ lệ 1: 1, ủ 55ºC trong 10 phút. - Chuyển sang cột lọc li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút 30 giây. - Bổ sung Wash buffer li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút 30 giây. - Chuyển cột lọc sang ống Eppendorf 1,5 ml mở nắp 5 phút.