3. Nội dung nghiên cứu
3.3. TẠO CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC GEN
dụng để lây nhiễm vào mô đã gây tổn thƣơng phục vụ cho mục đích chuyển gen vào cây trồng.
3.3. TẠO CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC GEN pPhaso-Cys2 pPhaso-Cys2
Tái sinh cây thuốc lá phục vụ chuyển gen là kỹ thuật tƣơng đối đơn giản và thời gian phân hóa từ mô đến cây hoàn chỉnh khá ngắn, nên trong những nghiên cứu về chuyển gen các nhà khoa học thƣờng chọn cây thuốc lá là cây mô hình. Vì vậy, những nghiên cứu về chuyển gen trên cây thuốc lá đã đƣợc tiến hành từ khá sớm nhằm mục đích đánh giá hoạt động của vector chuyển gen thông qua sự có mặt và biểu hiện của gen chuyển.
Chúng tôi đã tiến hành chuyển cấu trúc vector pPhaso- Cys2 mang gen Cys2 vào cây thuốc lá theo quy trình tái sinh đƣợc thể hiện ở hình 3.10. Đ
khuẩn lạc A. tumefaciens sau khi đƣợc khẳng định mang gen đích đã đƣợc nuôi trong môi trƣờng LB lỏng đến mật độ khuẩn đo đƣợc OD = 0,8-1,0 đem biến nạp vào cây thuốc lá Nicotiana tabacum K326 đã
đƣợc cắt tổn thƣơng 4 cạnh và nuôi cấy trên môi trƣờng cảm ứng GM trƣớc 2 ngày (Hình 3.10 A).
A B C
E D
Hình 3.10: Hình ảnh giai đoạn chuyển gen vào cây thuốc lá
A: Mảnh lá sau khi nhiễm khuẩn được cấy trên môi trường GM B: Mảnh lá được chuyển sang môi trường GM có bổ sung cefotaxime 400 mg/l, kanamycine 50 mg/l. C: Các cụm chồi được tạo thành sau hai tuần nuôi cấy trên môi trường GM có bổ sung cefotaxime 400 mg/l, kanamycine 50 mg/l. D: Các chồi màu xanh được tách ra trên môi trường tạo rễ RM có bổ sung cefotaxime 400mg/l, kanamycine 50mg/l.
E: Chồi cây chuyển gen sau 3 tuần trên môi trường tạo rễ RM có bổ sung cefotaxime 400 mg/l, kanamycine 50 mg/l.
Sau hai ngày đồng nuôi cấy trong tối, chúng tôi tiến hành rửa khuẩn bằng cefotaxime, cấy chuyển các mảnh lá sang môi trƣờng GM có bổ sung cefotaxime 400mg/l, kanamycine 50mg/l (Hình 3.10B). 2 - 3 tuần xuất hiện các chồi nhỏ (Hình 3.10C). Số mảnh lá sống sót trên môi trƣờng chọn lọc bằng kháng sinh là 60/66. Từ các mảnh lá, tiến hành tách các chồi nhỏ và cấy lên môi trƣờng MS cơ bản có bổ sung cefotaxime 400mg/l, kanamycine 50mg/l để nhân nhanh chồi.
Sau 4 - 5 tuần, chúng tôi thu đƣợc rất nhiều chồi từ các mảnh lá đã cảm ứng tạo mô sẹo (Hình 3.10D), các chồi phát triển cao khoảng 3cm thì đƣợc cắt
và chuyển sang môi trƣờng RM có bổ sung cefotaxime 400mg/l, kanamycine 3.10E).
Qua 2 lần biến nạp, kết quả thu đƣợc số cây ra rễ đã chọn lọc sơ bộ đƣợc thể hiện ở Bảng 3.3.
Bảng 3.3: Kết quả tạo cây thuốc lá chuyển gen Cys2
Biến nạp Tổng mảnh lá Số mảnh lá sống sót sau 3 tuần Số mảnh lá cảm ứng tạo chồi Số cây ra rễ trên môi trƣờng chọn lọc Lần 1 66 60 52 40 Lần 2 54 39 20 15 Tổng 120 99 72 55
Bảng 3.3 cho thấy số lƣợng mảnh lá sống sót trên môi trƣờng chọn lọc giảm dần theo thời gian, điều này cho thấy khả năng những mảnh lá tồn tại và phát triển đƣợc là những mô mang các tế bào đã đƣợc chuyển gen. Sau 3 - 4 tuần, có 99/120 mảnh lá sống sót trên môi trƣờng chọn lọc qua 2 lần biến nạp. Sau 6 - 8 tuần, 55 cây thuốc lá chuyển gen hoàn chỉnh đƣợc tạo thành.
Kết quả kiểm tra cây thuốc lá mang gen Cys2
Để kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trong cây thuốc lá chuyển gen, chúng tôi tiến hành tách DNA tổng số từ mẫu lá của 17 cây thuốc lá chuyển gen
Cys2 ngẫu nhiên. Kết quả tách DNA tổng số đƣợc thể hiện trong (Hình 3.11).
Hình 3.11: Ảnh điện di kiểm tra DNA tổng số tách từ lá cây thuốc lá; Giếng 1-17: các mẫu thuốc lá
Sau khi tách chiết DNA tổng số, chúng tôi tiếp tục PCR với cặp mồi CYS -F/R để kiểm tra sự có mặt của gen pPhaso- Cys2 trong cây thuốc lá. Vì số bản sao gen trong lá cây thƣờng ít hơn so với trong các mẫu vi khuẩn nên phản ứng PCR phải kéo dài hơn, trong thí nghiệm này chúng tôi cho lặp lại phản ứng 35 chu kỳ. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR đƣợc thể hiện trên hình 3.12.
Hình 3.12: Hình điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen Cys2 từ thuốc lá; Giếng 1,2: Đối chứng (-) và (+); 3-13: các mẫu thuốc lá; M: thang chuẩn 1kb
Kết quả thể hiện ở (Hình 3.12) cho thấy, sản phẩm PCR khi điện di có 11 mẫu có sản phẩm PCR, kích thƣớc khoảng 400bp. Kích thƣớc này hoàn toàn phù hợp với chiều dài cấu trúc Cys2 của gen chuyển. Nhƣ vậy,số cây thuốc lá mang gen Cys2 là 11/17. Vì vậy, có thể khẳng định gen Cys2 đã đƣợc chuyển vào cây thuốc lá. Nhƣ vậy, bƣớc đầu chúng tôi đã thu đƣợc cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc Cys2.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
500bp
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
1. KẾT LUẬN
1.1. Phân lập đƣợc đoạn mã hoá của gen Cys2 có kích thƣớc 405bp từ mRNA và đoạn mã hoá của gen Cys2 có sự sai khác ở 7 vị trí nucleotide so với trình tự của gen Cys2 mang mã số D38130 đã công bố trên ngân hàng gen quốc tế.
1.2. Thiết kế thành công vector chuyển gen mang gen Cys2 và đã biến nạp vào chủng vi khuẩn A. tumefaciens.
1.3. Tạo đƣợc cây thuốc lá mang gen Cys2 trong phòng thí nghiệm bằng phƣơng pháp chuyển gen gián tiếp qua A. tumefacien v
gen Cys2 với kích thƣớc khoảng 400bp (phù hợp với kích thƣớc gen đã xác định
trình tự) .
2. ĐÊ NGHỊ
Kiểm tra cấu trúc gen pPhaso-Cys2 ở hạt thuốc lá bằng cách phân tích thành phần protein.
C -Cys2 cây
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Trƣơng Văn Đích (2000), Kỹ thuật trồng ngô năng suất cao, NXB Nông nghiệp Hà Nội.
2. Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển (2007), ―Cấu trúc vector plasmid mang gen kháng sâu và ứng dụng trong tạo cây trồng chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefacien‖, Hội nghị khoa học công nghệ , tr. 345- 350.
3. Phạm Thị Hạnh, Phan Tƣờng Lộc, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ (2007), ―Tạo cây thuốc lá kháng thuốc trừ cỏ và côn trùng‖, phòng Công nghệ gen thực vật, Viện Sinh học nhiệt đới Hội nghị Khoa học và Công nghệ. 4. Lê Huy Hàm (2006), ―Sử dụng kỹ thuật biến nạp di truyền cải tạo một số đặc
tính nông sinh học ở ngô và lúa mỳ‖, Báo cáo Viện di truyền nông nghiệp.
5. (2013), ―
sâu (CryIAc Agrobacterium tumefaciens‖,
, , 29(3), tr. 17-29.
6. Bùi Công Hiển (1995), Côn trùng hại kho, NXB Khoa học và kỹ thuật Hà Nội. 7. Nguyễn Xuân Hiển (1972), Một số kết quả nghiên cứu về cây ngô, NXB
Khoa Học và Kỹ Thuật,Hà Nội.
8. Nguyễn Đức Lƣơng, Dƣơng Văn Sơn, Lƣơng Văn Hinh (2002), Giáo trình cây lương thực (dành cho sinh viên cao học), NXB Nông nghiệp.
9. Nguyễn Đức Lƣơng, Dƣơng Văn Sơn, Lƣơng Văn Hinh (2000), Giáo trình cây ngô, NXB Nông nghiệp. Tr. 14-32.
10. Chu Hoàng Mậu (2008), Phương pháp phân tích di truyền hiện đại trong
11. Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Thúy Hƣờng, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Chu Hoàng Hà (2011), Gen và đặc tính chịu hạn của cây đậu tương, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội.
12. TS Ngô Hữu Tình (2009), Giáo trình Cây ngô, NXB Nghệ An.
13. Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh (2005), Công nghệ sinh học nông nghiệp, NXB Đại học Sƣ phạm.
14. Phạm Thị Lý Thu (2007), ―Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh từ phôi non và xác định phƣơng pháp chuyển gen thích hợp ở ngô‖, Luận án tiến sĩ sinh học (146 tr).
15. Vũ Thị Thu Thủy (2011), ―Tạo dòng chịu hạn và phân lập gen Cystatin
liên quan đến tính chịu hạn ở cây lạc‖, Luận án tiến sĩ sinh học, Trƣờng
Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên. 16.
(2009), ― ,
, 7(2), tr. 221-227.
17. Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp,(2007), Công nghệ sinh học- tập 2- Công nghệ sinh học tế bào. NXB Giáo dục. p. 91- 95.
18. Abe K., Emori Y., Kondo H., Susuki K., Aria S. (1987), "Molecular cloning of a cystein proteinase inhibitor of rice (Oryzacystatin) - Homology with animal cystatin and transient expression in the ripening
process of rice seeds", J Biol Chem, 262 (35), 16793-16797.
19. Adeniala S. O., José X. F., Sales M. P.(2003), "Cysteine proteinases and
cystatins", Braz. arch. biol. technol, 46 (1), 99-104.
20. Anima S. E., Mgutu A. J., Taracha C., Coussens G., Karimi M., Hilson P., Lijsebettens M. V., Machuka J. (2010), ―Somatic embryogenesis and plant regeneration of tropical maize genotypes‖, Plant Cell Tiss Organ Cult , 2, pp. 285-295.
21. Barrett, A. J. (1994) "Classification of peptidases", Methods Enzymol.
244, pp. 1–15.
22. Bode W., Engh R., Musil D., Thiele U., Huber R.,Karshnikov A., Brzin J., Kos J. & Turk V. (1990), " Mechanism of interaction oF cysteine ptoteinases and their protein inhibitors as compared to the serine proteinase inhibitor interaction", Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 371, pp. 111-118.
23. Carrillo L., Martinez M., Ramessar K., Cambra I., Castanera P., Ortego F., I. D. (2011), "Expression of a barley cystatin gene in maize enhances
resistance", Plant Cell Reports, 101-112.
24. Chan M. T., Lee T. M., Chang H. H. (1992), ―Transformation of indica rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens‖, Plant Cell Physiol, 33, pp. 577- 583.
25. Chan M. T., Chang H. H., Ho S. L., Tong W. F., Yu S. M. (1993), ―Agrobacterium-mediated production of transgenic rice plants expressing a chimeric a-amylas promoter / P-glucuronidase gene‖, Plant Mo1 Biol, 22,
pp. 491-506.
26. Cheng M., Fry J. E., Pang S., et al. (1997), ―Genetic transformation of wheat mediated by Agrobacterium tumefaciens‖, Plant Physiology,
115(3), pp. 971-980.
27. David R. (2004), Insects stored products. CSIRO Australia.
28. Frame B. R., Shou H., Chikwamba R., Zhang Z., Xiang C., Fonger T. M., Pegg S. E. K., Li B., Nettleton , Pei D. & Wang K. (2002), ―Agrobacterium tumefaciens -mediated Transformation of Maize Embryos Using a Standard Binary Vector System‖, Plant Physiol, 129,
pp. 12-22.
29. Frame B. R., McMurray J. M., Fonger T. N., Main M. L., Taylor K. W., Torney F. J., Paz M. M.., Wang K. (2006), ―Improved Agrobacterium-
mediated transformation of three maize inbred lines using MS salts‖,
Plant Cell Rep, 25(10), pp. 1024-1034.
30. Hiei Y., Ohta S., Komari T., Kumashiro T. (1994), ―Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and
sequence analysis of the boundaries of the T-DNA‖, Plant J, 6(2), pp.
271-82.
31. Ishida Y., Saito H., Ohta S., Hiei Y., Komari T., and Kumashiro T. (1996), ―High efficiency transformation of maize (Zea mays L.) mediated by
Agrobacterium tumefaciens‖, Nature Biotechnology, 14(6), pp. 745–750.
32. Ishida Y., Hiei Y., Komari T. (2007), ―Agrobacteium-mediated transformation of maize‖, Nature Protocol, 12(7), pp. 1614-1621.
33. James A. O., Adebayo A. O (2012), "Rearing the Maize Weevil, Sitophilus zeamais, on an Artificial Maize—Cassava Diet", J Insect Sci, 12.
34. Kim H. A., Utomo S. D., Kwon S. Y., Min S. R., Kim J. S., Yoo H. S. and Choi P. S. (2009), ―The development of herbicide-resistant maize: stable
Agrobacterium-mediated ransformation of maize using explants of type II
embryogenic calli‖, Plant Biotechnol Rep, 3(4), pp. 277-283.
35. Kuschel G. (1961), "On problem of synonymy in the Sitophyllus oryzae
complex (30th contribution, Col. Curculionidea)", Annals and Magazine of
Nature History, 13(4), pp. 241-244.
36. Li N., Zhang S., Zhao Y., Li B., Zhang J. (2011), ―Over-expression of AGPase genes enhances seed weight and starch content in transgenic maize‖, Planta, 233, pp. 241-250.
37. Massonneau A., Condamine P., Wisniewski J. P., Zivy M., Rogowsky P. M. (2005), "Maize cystatins respond to developmental cues, cold stress
38. Mikami A. Y., Carpentieri P. V., Ventura M. U. (2012), "Resistance of maize landraces to the maize weevil Sitophilus zeamais Motsch.(Coleoptera: Curculionidae)." Neotrop Entomol, 41 (5), 404-8.
39. Mwololo J. K., Mugo S., Okori P., T. Tefera, Otim M., S. W. M. (2012), "Sources of Resistance to the Maize Weevil Sitophilus zeamais in
Tropical Maize", Journal of Agricultural Science, 4 (11).
40. Ombori O., Muoma J. V. O., Machuka J. (2012), ―Agrobacterium- mediated genetic transformation of selected tropical inbred and hybrid maize (Zea mays L.) lines‖, Plant Cell Tiss Org, DOI 10.1007/s11240-
012-0247-1.
41. Rawlings, N. D. & Barrett, A. J. (1999) "MEROPS:The peptidase database", Nucleic Acids Res, 27, pp. 325–331.
42. Sambrook J., Russell D. W., eds (2001), ―Molecular Cloning: laboratory Manual, 1st ed. Cold Spring Harbor laboratory Press‖, Cold Spring Harbor, NY.
43. Shu-Guo FAN, WU G. J. (2005), "Characteristics of plant proteinase inhibitors and their applications in combating phytophagous insects", Bot.
Bull. Acad Sin, 46, 273-92.
44. Sidorov V., Gilbertson L., Addae P., Duncan D. (2006), ―Agrobacterium- mediated transformation of seedling-derived maize callus‖, Plant Cell Rep, 25, pp. 320-328.
45. Takava S., Rahnama H., Rahimian H., and Kazemitabar K. (2010), ―Agrobacterium Mediated Transformation of Maize (Zea mays L.)‖,
Journal of Sciences, Islamic Republic of Iran, 21(1), pp. 21-29.
46. Tefera T., Demissie G., Mugo S., Y. B. (2013), "Yield and agronomic performance of maize hybrids resistant to the maize weevil Sitophilus zeamais Motschulsky (Coleoptera: Curculionidae)", pp. 91-99.
47. Topping J. F, Foster G. D, Taylor S. C. (1998), ―Plant virology protocols, from virus isolation to fransgenic resistance‖, HumanPress, Totowa, 81,
pp. 365-485.
48. Turk B., Turk V., Turk D. (1997), "Structural and functional aspects of papain-like cysteine proteinase and their protein inhibitor", Biol. Chem. Hopp seyler , 378, pp. 141-150.
49. Vega J. M., Yu W., Kennon A. R., Chen X., Zhang Z. J. (2008), ―Improvement of Agrobacterium-mediated transformation in Hi-II maize (Zea
mays L.) using standard binary vectors‖, Plant Cell Rep, 27, pp. 297-305.
50. Wang Z., Chen X., Wang J., Liu T., Liu Y., Zhao L., Wang G. (2007), ―Inreasing maize seed weight by enhancing the cytoplasmic DP-glucose pyrophosphorylase activity in transgenic maize plants‖, Plant Cell Tiss Organ, 88, pp. 83-92.
51. Wang T. T., Ji J., Wang G., Guan C. F., Zhang L., Jin C. (2012), ―Study on Agrobacterium-mediated transformation of psy gene into shoot
meristem of maize‖, China Biol, 32(8), pp. 36-40.
52. http://www.ctu.edu.vn. 53. http://en.wikipedia.org/wiki/Maize_weevil. 54. http://faostat.fao.org/. 55. http://www.gso.gov.vn 56. http: //www.ncbi.nlm.nih.gov./sites/nuccore/AF45439 57. http: //www.ncbi.nlm.nih.gov./sites/nuccore/D63342. 58. http: //www.ncbi.nlm.nih.gov./sites/nuccore/D64115 59. http://old.padil.gov.au/pbt/index.php?q=node/70&pbtID=217. 60. http://www.vietrade.gov.vn/. 61. http://vi.wikipedia.org/wiki/ngô.
PHỤ LỤC
Sơ đồ cấu trúc các vector sử dụng trong nghiên cứu
A. Vector tách dòng pBT; B. Vector tách dòng pENTRTM/D-TOPO®;