3. Nội dung nghiên cứu
2.2.3.Phƣơng pháp tạo vector chuyển gen mang cấu trúc gen Cys2 bằng
thuật Gateway
Trong nghiên cứu này, sau khi thiết kế thành công vector nhân dòng pENTRTM/D-TOPO® mang đoạn gen quan tâm, chúng tôi tiến hành phản ứng tái tổ hợp LR giữa vector chuyển gen pPhaso-dest với plasmid pENTRTM
/D- TOPO® mang đoạn gen Cys2 (Hình 2.3). Các cấu trúc đều đƣợc kiểm soát sự
biểu hiện bởi promoter đặc trƣng trong hạt phasoline.
Hình 2.2: Sơ đồ minh họa phản ứng LR giữa pENTR- Cys2 với pPhaso-dest
Phản ứng LR đƣợc thực hiện với thành phần (Bảng 2.10) và theo các bƣớc sau:
Bảng 2.10: Thành phần phản ứng LR STT Thành phần Thể tích (μl) 1 Plasmid pEN-gene (50 - 150 ng) 2 2 Vector pPhaso-dest (150 ng/ μl) 2 3 TE 1X 4 Tổng 8 Các bước tiến hành:
(1) Bổ sung các thành phần trên vào ống ly tâm 1.5 ml ở nhiệt độ phòng và trộn nhẹ.
(2) Làm tan hỗn hợp enzyme LR ClonaseTM
trên đá khoảng 2 phút. Trộn nhẹ 2 lần, mỗi lần khoảng 2 giây.
(3) Bổ sung vào ống ly tâm 2 μl enzyme LR ClonaseTM
để phản ứng và đảo nhẹ nhàng 2 lần.
(4) Ủ phản ứng ở 25°C trong 1h. Bổ sung 1 μl dung dịch proteinase K để kết thúc phản ứng. Đảo nhẹ, ủ ở 37°C trong 10 phút.
Biến nạp
(1) Chuyển 3 μl phản ứng LR vào 50 μl tế bào E.coli One Shot®
Top 10.
(2) Ủ trong đá 30 phút. Sốc nhiệt tế bào ở 42ºC trong 45 giây. (3) Bổ sung 300 μl LB lỏng. Ủ ở 37ºC trong 1 giờ bằng máy lắc.
(4) Chuyển 50- 250 μl vào các đĩa chọn lọc chứa kháng sinh streptomycin 40 mg/l, spectinomycine 100 mg/l.
Chọn dòng bằng phản ứng PCR:
Chọn 4 khuẩn lạc nuôi qua đêm ở 37ºC trong 4ml LB lỏng có bổ sung kháng sinh Spectinomycine 100mg/l thích hợp để tách chiết plasmid. Sau đó tiến
hành phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu để chọn các dòng khuẩn biến nạp thành công.