Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu thuộc phòng di truyền vi sinh vật, phòng máy chung về công nghệ gen Viện công nghệ sinh học, gồm có:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Tên thiết bị Hãng sản xuất
Máy chạy PCR Bộ điện di ADN Máy chụp ảnh gen Máy li tâm
Kính hiển vi đối pha Máy khuấy trộn Vortex Cân phân tích 10-4 Pipet man các loại Lò vi sóng Tủ lạnh -200 C Tủ lạnh –800 C Tủ ấm PTC – 100, Mỹ Thuỵ Điển
Gen Doc pharmacia Eppendof, Đức Olympus, Nhật Rotolab, OSI, Pháp Mettlelex toledo Gilson, Pháp Electrolux, Nhật Frigor, Đan Mạch Sanyo, Nhật Fiocell, Đức 2.2.3. Môi trƣờng
1. Môi trường phân lập và giữ giống MPA:
Cao thịt: 3 – 5g NaCl: 5g Pepton: 10g H2O: 1l Thạch: 20g pH: 7 – 7,2
2. Môi trường Craige dùng phân lập chủng có khả năng chuyển động MT1: Cao thịt: 3 – 5g NaCl: 5g
Pepton: 10g H2O: 1l Thạch: 8g pH: 7 – 7,2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3. Môi trường MPB nuôi cấy Bt để thử huyết thanh:
Cao thịt: 3 – 5g NaCl: 5g Pepton: 10g H2O: 1l pH: 7 – 7,2
Các dung dịch dùng trong tách chiết DNA plasmid
Dung dịch Sol I: Tris HCl pH = 8.0: 20mM.
EDTA pH = 8.0: 10mM Glucose: 50mM
Dung dịch Sol II: NaOH: 20mM.
SDS: 1%
Dung dịch Sol III: CH3COOK: 60ml CH3COOH: 11.5ml H2O: 28.5ml
Các dung dịch dùng trong điện di trên gel agarose
Dung dịch TE:
Tris HCl pH = 8.0: 20mM. EDTA pH = 8.0: 10mM Glucose: 50mM
Dung dịch đệm điện di TAE 50X:
Tris bazơ 121g
Axit acetic 5M: 28.6 ml EDTA 0.5M pH=8.0: 50ml
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Nước khử ion đủ 500ml
Dung dịch đệm tra mẫu DNA (loading buffer) 5X:
Tris HCl 1M pH= 8.0: 1ml EDTA 0.5M pH=8.0: 2ml Glycerol: 2ml
Bromphenol blue 1%: 2ml
Gel điện di agarose 1%: agarose 1g, TAE 1X 100ml
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phƣơng pháp xác định nồng độ bào tử
Các chủng Bt phân lập được sử lý ở 650C trong 30 phút hoặc 700
C trong 15 phút để loại bỏ tế bào sinh dưỡng. Sau đó tiến hành pha loãng với
nồng độ giảm dần từ 10-1
đến 10-11, ở các nồng độ từ 10-9
đến 10-11 cấy vào
đĩa Petri có chứa môi trường MPA mỗi nồng độ cấy vào 3 đĩa. Nuôi ở 280
C sau 24 giờ đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa có nồng độ pha loãng nhỏ nhất. Từ đó số lượng bào tử được tính theo công thức:
X = n.a.10
X: số lượng bào tử trong 1ml dịch nuôi cấy
n: số khuẩn lạc trung bình tạo thành trong 100 μl dịch pha loãng a: nồng độ pha loãng
2.3.2. Phƣơng pháp thử hoạt tính sinh học
Thử hoạt tính trên sâu theo phương pháp nhúng đĩa lá của Thiery và Frachon.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Loại sâu thử: Sâu tơ, dùng sâu tuổi 2 đầu tuổi 3, không cho sâu ăn
trước 3 giờ.
- Mẫu để thử: Lá cải xanh, lá bắp cải, lá đậu tương hoặc thức ăn nhân tạo. Tuỳ theo từng loại sâu mà ta chọn lá thử cho phù hợp; Ở đây ta chọn lá cải xanh. Chọn lá là những lá sạch, không phun thuốc sâu, không sâu bệnh, rửa sạch tráng qua bằng nước cất, để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng. Sau đó, cắt lá với diện tích đều nhau cho vào đĩa Petri đã khử trùng.
Pha loãng các chủng Bt đã phân lập ở các nồng độ 105 và 107 tế bào/1ml.
Nhúng lá thử vào dịch Bt phân lập đã pha loãng, để 10 phút lấy ra để khô ở
nhiệt độ phòng. Sau đó lấy lá cho vào các đĩa Petri (có ghi nồng độ thử) và mỗi nồng độ thử 10 con sâu.
Nuôi ở nơi thoáng mát và theo dõi tỷ lệ sâu chết sau 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ. Song song với mẫu thử ngiệm ta tiến hành mẫu đối chứng: lá rửa sạch để khô tự nhiên, cho lá khô vào đĩa Petri và thả 10 con sâu trên một đĩa, theo dõi tỷ lệ chết tương tự như mẫu thí nghiệm [42].
Tỉ lệ sâu chết được tính theo công thức Abbott: A = (C – T)/C . 100
A: % sâu chết
C: Số sâu sống ở mẫu đối chứng T: Số sâu sống ở mẫu thí nghiệm
2.3.3. Kỹ thuật định typ huyết thanh
Các chủng Bt được cấy vào ống craige (ống thủy tinh nhỏ, được cắm
thẳng đứng vào môi trường craige chứa trong ống nghiệm), nuôi ở tủ 280
C trong 24-48 giờ khi đó, những tế bào có khả năng chuyển động sẽ di chuyển
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
lên phía trên bề mặt môi trường giữa ống craige và ống nghiệm. Vi khuẩn phát triển ở bề mặt này sẽ được cấy vào ống nghiệm có chứa 2ml môi trường LB, lắc ở 70-75 vòng/ phút trong 12 giờ.
Phản ứng ngưng kết với kháng huyết thanh tương ứng được quan sát trên kính hiển vi: lấy 2µl dịch nuôi nhỏ trên phiến kính lõm để kiểm tra khả năng chuyển động của vi khuẩn, sau đó nhỏ tiếp 2 huyết thanh chuẩn (đã pha
loãng) và quan sát dưới kính hiển vi[3].
2.3.4. Phƣơng pháp tách DNA plasmid
- Lấy khuẩn lạc vi khuẩn cấy vào 2 ml môi trường LB, lắc qua đêm 200
vòng/phút ở 370
C.
- Hút 1,5 ml dịch nuôi đem ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút
- Loại dịch nổi thu cặn và bổ xung 150 μl dung dịch Sol I, vortex làm tan tủa.
- Bổ xung 150 μl dung dịch Sol II, đảo nhẹ và để đá 5 phút. - Bổ xung 150 μl dung dịch Sol III, đảo nhẹ và để đá 5 phút.
- Li tâm 12000 vòng/phút, thu dịch nổi, bổ xung 1 μl cồn tuyệt đối, ủ -200C ít nhất trong 2 giờ.
- Li tâm 12000 vòng/phút, thu cặn và để khô.
- Bổ xung 30 – 40 μl RNAse, ủ trong 1 giờ ở 370C.
- Bổ xung 500 μl nước khử ion. Đẩy lên tới 1,5 μl bằng Choloroform : isoamyl alcohol (24:1).
- Li tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi (khoảng 400 μl). - Bổ xung 1/10 NaOAC hoặc KOAC, đẩy lên 1,5 μl bằng cồn tuyệt đối, ủ - 200
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Li tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C, thu tủa, rửa bằng cồn 70% (300 μl).
- Li tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút, thu cặn và để khô. - Bổ xung 40 μl nước khử ion làm tan tủa.
- Bảo quản -200C.
2.3.5. Phƣơng pháp PCR để khuếch đại gen cry1Ab, cry1Ac
Thành phần phản ứng PCR cho một chủng một cặp mồi với tổng thể tích 20 μl: dNTPs 2 μl Buffer 2 μl MgCl2 4,8 μl Primer F1 1 μl Primer F2 1 μl Primer R 2 μl Taq 0,3 μl DNA 1 μl Nước khử ion 5,9 μl
-Primer F1: mồi xuôi gen cry1Ab
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Cặp mồi Gen Sản phẩm
(bp) TYIAB 5’- GAGCCAAGCAGCTGGAGCAGTTTACACC 3’ TYIUNI 5’- TCACTGAGTCGCTTCGCATGTTTGACTTTCTC 3’ cry1Ab 238 bp TYIAC 5’ - TCACTTCCCATCGACATCTACC 3’ TYIUNI 5’- TCACTGAGTCGCTTCGCATGTTTGACTTTCTC 3’ cry1Ac 487 bp Chu trình nhiệt 94oC 94oC 52oC 72oC 72oC 4oC 2 phút 1 phút 1 phút 1 phút 10 phút forever 30 chu kì
2.3.6. Phƣơng pháp tách dòng gen cry1Ab, cry1Ac
2.3.6.1 Gắn sản phẩm PCR vào vectơ tách dòng pGEM – T Easy
Sản phẩm PCR được gắn trực tiếp vào vectơ tách dòng nhờ enzym nối
T4 – DNA ligase. Thành phần phản ứng: Buffer 5µl Vectơ 1µl T4 – DNA ligase 1µl Sản phẩm PCR 3µl
Quá trình nối ghép được thực hiện trong điều kiện 4 – 6o
C để tạo vectơ tái tổ hợp.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.3.6.2 Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E.coli DH5α
Chuẩn bị tế bào khả biến:
- Nuôi cấy 1 khuẩn lạc E. coli DH5α trong môi trường LB lỏng qua đêm.
- Chuyển 0,5ml dịch nuôi cấy tế bào qua đêm sang 50ml môi trường LB, lắc 200 vòng/phút trong 2h ở 370C. Đo OD600 đạt 0,5 – 0,6 thì lấy mẫu
đặt trên đá 1h. Sau từ bước này thao tác luôn phải được thực hiện ở 40
C.
- Mẫu sau đặt đá 1h đem ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút, loại
dịch nổi. Hòa tế bào thu được trong 50ml CaCl2 100mM vô trùng, ủ trong 15
phút và ly tâm thu tủa ở 6000 vòng/ phút.
- Hòa lại tủa trong 25 ml CaCl2 100mM, ủ mẫu trên đá trong 60 phút.
- Ủ xong ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C. Hòa tế bào trong
0,5 ml CaCl2 100mM, bổ xung 15% glycerol. Hút 10 μl dịch tế bào vào mỗi
ống eppendorf và bảo quản -800
C.
Biến nạp:
- Hút 4 μl sản phẩm của phản ứng nối ghép gen vào 100 μl dung dịch tế
bào khả biến và trộn đều, để đá 30 phút (nhằm tạo cho hỗn hợp có một nhiệt độ thấp nhất định và tạo điều kiện cho vector tái tổ hợp tiếp cận tế bào một
cách động đều), sốc nhiệt 420
C trong 60 giây sau đó giữ hỗn hợp này trong đá 2 phút. Bổ xung thêm 300 μl môi trường LB và lắc ở 370
C 200 vòng/phút trong 1h. Trải 50 μl sản phẩm trên đĩa petri chứa môi trường MPA có bổ xung
Ampicillin + X-gal, nuôi ở 370C từ 14h – 16h.
2.3.6.3 Phƣơng pháp tách DNA plasmid của vi khuẩn E.coli DH5α
Lấy khuẩn lạc vi khuẩn chứa plasmid tái tổ hợp (khuẩn lạc màu trắng), và khuẩn lạc vi khuẩn không chứa plasmid tái tổ hợp (khuẩn lạc màu xanh) làm đối chứng cấy vào 2ml môi trường LB có chứa chất kháng sinh
Ampicillin nồng độ 100mg/ml, lắc 200 vòng/phút qua đêm ở 37o
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Quá trình tách plasmid được tiến hành như với tách DNA plasmid vi khuẩn Bt.
- Để xác định chính xác vectơ tái tổ hợp có mang đoạn gen mong muốn
hay không, chúng tôi tiến hành cắt đoạn DNA đã ghép nối vào plasmid bằng enzym EcoRI.
- Trình tự enzym EcoRI 5’……GAATTC……3’ 3’……CTTAAG……5’ - Thành phần phản ứng: EcoRI 0,3µl Buffer 1µl DNA 3µl Nước khử ion 5,7µl
- Quá trình cắt được thực hiện ở 37oC qua đêm.
2.3.7. Xác định trình tự nucleotid của đoạn gen đã tách dòng
Tiến hành theo phương pháp tổng hợp của Sanger và cộng sự.
Thực hiện phản ứng PCR ngoài các thành phần thông thường còn bổ sung thêm loại dideoxynuceotid (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) đã được đánh dấu bằng thuốc nhuộm huỳnh quang.
Điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamid có bổ sung ure làm tăng khả năng phân giải của gen. Dùng tia laze quét để phát hiện dideoxynucleotid đánh dấu.
Xử lý kết quả bằng phần mềm PC/GENE, sau đó tiến hành so sánh trình tự gen đã tách dòng với các trình tự đã công bố trong Ngân hàng Gen quốc tế.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis mang gen cry1Ab, cry1Ac có hoạt tính diệt côn trùng bộ cánh vảy
3.1.1. Đặc điểm hình thái của Bacillus thuringiensis
Từ các chủng vi sinh vật thu nhận được từ phòng Di truyền Vi sinh vật.
Chúng tôi tiến hành nuôi cấy trên môi trường MPA và ủ ở nhiệt độ 280
C. Sau
3 ngày nuôi cấy trên bề mặt môi trường xuất hiện các khuẩn lạc Bt. Khuẩn lạc
Bt là những khuẩn lạc: tròn, có màu trắng sữa, có mép nhăn hoặc không.
Mỗi đĩa nuôi tách 3 khuẩn lạc riêng rẽ, đặc trưng cho nhóm Bc – Bt để quan sát dưới kính hiển vi quang học ở vật kính dầu, tiêu bản nhuộm đơn với
Fushin. Qua đó lựa chọn được các chủng Bt có khả năng hình thành bào tử và
tinh thể.
Hình 3.1. Hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn Bt trên môi trƣờng MPA sau 72 giờ nuôi cấy ở 280
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.1.2. Hình dạng tinh thể của các chủng Bt
Các protein tinh thể của Bt có 4 dạng: hình lưỡng tháp, hình ovan, hình lập phương và hình không xác định. Các chủng khác nhau có khả năng sinh ra tinh thể có hình dạng khác nhau.
Bằng phương pháp quan sát sơ bộ trực tiếp trên kính hiển vi quang học ở vật kính dầu với tiêu bản nhuộm đơn bằng fushin, chúng tôi tiến hành phân
loại hình dạng tinh thể cho các chủng Bt phân lập (bảng 3.1)
Bảng 3.1. Sự phân bố hình dạng tinh thể của các chủng Bacillus thuringiensis
STT Hình dạng Số chủng Tỉ lệ (%) 1 Hình lưỡng tháp 14 50 2 Hình cầu 7 25 3 Hình cầu, hình lưỡng tháp 5 17,8 4 Hình lập phương, hình cầu 1 3,6 5 Cầu-Lưỡng tháp-Lập phương 1 3,6
Từ số liệu thống kê ở bảng 1 ta thấy các chủng Bt phân lập đều sinh tinh
thể, trong đó các chủng sinh tinh thể hình lưỡng tháp chiếm ưu thế (50%).
Ngoài ra ta thấy còn có các chủng Bt sinh ra 2 loại tinh thể (21,4%) và 3 loại
tinh thể (3,6%). Điều này thể hiện tính đa dạng về hình dạng tinh thể của chủng Bt phân lập tại Thái Nguyên và qua đó cho thấy Bt có phổ diệt côn trùng rộng từ côn trùng bộ cánh vảy, bộ cánh cứng, bộ hai cánh tới giun tròn thực vật.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.1.3. Phân loại Bt bằng phƣơng pháp huyết thanh
Vi khuẩn Bt được chia làm rất nhiều dưới loài khác nhau, mỗi dưới loài
mang các đặc điểm riêng biệt. Dưới loài Bt. var. kustaki có khả năng diệt côn trùng bộ cánh vảy thuộc typ huyết thanh H3a, 3b,3c
Với kit huyết thanh miễn dịch chuẩn nhận từ phòng Di truyền Vi sinh vật chúng tôi tiến hành sàng lọc các chủng Bt. var. kustaki bằng cách sử dụng typ huyết thanh H3a, 3b, 3c
Với phương pháp phân loại được trình bày ở phần 2.3.3, kết quả là 21 trên tổng số 28 chủng nghiên cứu được khẳng định thuộc dưới loài kustaki
thông qua phản ứng ngưng kết với typ huyết thanh H3a, 3b,3c. Các chủng này
được chúng tôi tiến hành tách plasmid để phát hiện gen cry1Ab và gen cry1Ac
bằng phương pháp PCR
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.1..4. Phát hiện gen cry1Ab, cry1Ac ở các chủng Bt var. kustaki bằng phƣơng pháp PCR
Nhóm gen mã hóa protein Cry1Ab và Cry1Ac đã và đang được các nhà
khoa học quan tâm nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn. Protein tinh thể độc tố của nhóm gen này có tác dụng với nhiều loài côn trùng bộ cánh vẩy. Gen
cry1Ab, cry1Ac phát hiện thuộc một trong các dưới loài được trình bày ở mục 1.2.6.5 phần Tổng quan tài liệu, trong đó dưới loài Bacillus thuringiensis var.
kurstaki mang cả hai loại gen cry1Ab, cry1Ac mã hóa tinh thể độc tố Cry1Ab, Cry1Ac có hoạt tính diệt sâu tơ thuộc bộ cánh vẩy. Để phát hiện các gen độc
tố này, chúng tôi sử dụng phương pháp PCR để khuếch đại cặp gen cry1Ab,
cry1Ac với các cặp mồi đặc hiệu của chúng. Theo tính toán lí thuyết, đoạn gen
cry1Ab sau khi tổng hợp với cặp mồi đặc hiệu sẽ thu được sản phẩm có chiều
dài 238bp và đoạn gen cry1Ac là 487bp. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra
trên gel agarose 1% (Hình 3.4).
Hình 3.3. Hình ảnh ngƣng kết của chủng Btk 3.4TN (1) và chủng đối chứng 4D4(2) với typ huyết H3a,3b,3c dƣới kính hiển vi quang học
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 3.2. Bảng kết quả các chủng Baccillus thuringiensis var kustaki mang gen STT Tên chủng Gen 1 DT1.3.1 cry1Ab cry1Ac 2 36.8TN cry1Ab cry1Ac 3 2.5TN cry1Ab cry1Ac 4 5.15TN cry1Ab cry1Ac 5 3.4TN cry1Ab cry1Ac 6 6.8TN cry1Ab cry1Ac 7 TC9.1 cry1Ab cry1Ac