Các chủng Bt được cấy vào ống craige (ống thủy tinh nhỏ, được cắm
thẳng đứng vào môi trường craige chứa trong ống nghiệm), nuôi ở tủ 280
C trong 24-48 giờ khi đó, những tế bào có khả năng chuyển động sẽ di chuyển
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
lên phía trên bề mặt môi trường giữa ống craige và ống nghiệm. Vi khuẩn phát triển ở bề mặt này sẽ được cấy vào ống nghiệm có chứa 2ml môi trường LB, lắc ở 70-75 vòng/ phút trong 12 giờ.
Phản ứng ngưng kết với kháng huyết thanh tương ứng được quan sát trên kính hiển vi: lấy 2µl dịch nuôi nhỏ trên phiến kính lõm để kiểm tra khả năng chuyển động của vi khuẩn, sau đó nhỏ tiếp 2 huyết thanh chuẩn (đã pha
loãng) và quan sát dưới kính hiển vi[3].
2.3.4. Phƣơng pháp tách DNA plasmid
- Lấy khuẩn lạc vi khuẩn cấy vào 2 ml môi trường LB, lắc qua đêm 200
vòng/phút ở 370
C.
- Hút 1,5 ml dịch nuôi đem ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút
- Loại dịch nổi thu cặn và bổ xung 150 μl dung dịch Sol I, vortex làm tan tủa.
- Bổ xung 150 μl dung dịch Sol II, đảo nhẹ và để đá 5 phút. - Bổ xung 150 μl dung dịch Sol III, đảo nhẹ và để đá 5 phút.
- Li tâm 12000 vòng/phút, thu dịch nổi, bổ xung 1 μl cồn tuyệt đối, ủ -200C ít nhất trong 2 giờ.
- Li tâm 12000 vòng/phút, thu cặn và để khô.
- Bổ xung 30 – 40 μl RNAse, ủ trong 1 giờ ở 370C.
- Bổ xung 500 μl nước khử ion. Đẩy lên tới 1,5 μl bằng Choloroform : isoamyl alcohol (24:1).
- Li tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi (khoảng 400 μl). - Bổ xung 1/10 NaOAC hoặc KOAC, đẩy lên 1,5 μl bằng cồn tuyệt đối, ủ - 200
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Li tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C, thu tủa, rửa bằng cồn 70% (300 μl).
- Li tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút, thu cặn và để khô. - Bổ xung 40 μl nước khử ion làm tan tủa.
- Bảo quản -200C.
2.3.5. Phƣơng pháp PCR để khuếch đại gen cry1Ab, cry1Ac
Thành phần phản ứng PCR cho một chủng một cặp mồi với tổng thể tích 20 μl: dNTPs 2 μl Buffer 2 μl MgCl2 4,8 μl Primer F1 1 μl Primer F2 1 μl Primer R 2 μl Taq 0,3 μl DNA 1 μl Nước khử ion 5,9 μl
-Primer F1: mồi xuôi gen cry1Ab
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Cặp mồi Gen Sản phẩm
(bp) TYIAB 5’- GAGCCAAGCAGCTGGAGCAGTTTACACC 3’ TYIUNI 5’- TCACTGAGTCGCTTCGCATGTTTGACTTTCTC 3’ cry1Ab 238 bp TYIAC 5’ - TCACTTCCCATCGACATCTACC 3’ TYIUNI 5’- TCACTGAGTCGCTTCGCATGTTTGACTTTCTC 3’ cry1Ac 487 bp Chu trình nhiệt 94oC 94oC 52oC 72oC 72oC 4oC 2 phút 1 phút 1 phút 1 phút 10 phút forever 30 chu kì
2.3.6. Phƣơng pháp tách dòng gen cry1Ab, cry1Ac
2.3.6.1 Gắn sản phẩm PCR vào vectơ tách dòng pGEM – T Easy
Sản phẩm PCR được gắn trực tiếp vào vectơ tách dòng nhờ enzym nối
T4 – DNA ligase. Thành phần phản ứng: Buffer 5µl Vectơ 1µl T4 – DNA ligase 1µl Sản phẩm PCR 3µl
Quá trình nối ghép được thực hiện trong điều kiện 4 – 6o
C để tạo vectơ tái tổ hợp.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.3.6.2 Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E.coli DH5α
Chuẩn bị tế bào khả biến:
- Nuôi cấy 1 khuẩn lạc E. coli DH5α trong môi trường LB lỏng qua đêm.
- Chuyển 0,5ml dịch nuôi cấy tế bào qua đêm sang 50ml môi trường LB, lắc 200 vòng/phút trong 2h ở 370C. Đo OD600 đạt 0,5 – 0,6 thì lấy mẫu
đặt trên đá 1h. Sau từ bước này thao tác luôn phải được thực hiện ở 40
C.
- Mẫu sau đặt đá 1h đem ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút, loại
dịch nổi. Hòa tế bào thu được trong 50ml CaCl2 100mM vô trùng, ủ trong 15
phút và ly tâm thu tủa ở 6000 vòng/ phút.
- Hòa lại tủa trong 25 ml CaCl2 100mM, ủ mẫu trên đá trong 60 phút.
- Ủ xong ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C. Hòa tế bào trong
0,5 ml CaCl2 100mM, bổ xung 15% glycerol. Hút 10 μl dịch tế bào vào mỗi
ống eppendorf và bảo quản -800
C.
Biến nạp:
- Hút 4 μl sản phẩm của phản ứng nối ghép gen vào 100 μl dung dịch tế
bào khả biến và trộn đều, để đá 30 phút (nhằm tạo cho hỗn hợp có một nhiệt độ thấp nhất định và tạo điều kiện cho vector tái tổ hợp tiếp cận tế bào một
cách động đều), sốc nhiệt 420
C trong 60 giây sau đó giữ hỗn hợp này trong đá 2 phút. Bổ xung thêm 300 μl môi trường LB và lắc ở 370
C 200 vòng/phút trong 1h. Trải 50 μl sản phẩm trên đĩa petri chứa môi trường MPA có bổ xung
Ampicillin + X-gal, nuôi ở 370C từ 14h – 16h.
2.3.6.3 Phƣơng pháp tách DNA plasmid của vi khuẩn E.coli DH5α
Lấy khuẩn lạc vi khuẩn chứa plasmid tái tổ hợp (khuẩn lạc màu trắng), và khuẩn lạc vi khuẩn không chứa plasmid tái tổ hợp (khuẩn lạc màu xanh) làm đối chứng cấy vào 2ml môi trường LB có chứa chất kháng sinh
Ampicillin nồng độ 100mg/ml, lắc 200 vòng/phút qua đêm ở 37o
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Quá trình tách plasmid được tiến hành như với tách DNA plasmid vi khuẩn Bt.
- Để xác định chính xác vectơ tái tổ hợp có mang đoạn gen mong muốn
hay không, chúng tôi tiến hành cắt đoạn DNA đã ghép nối vào plasmid bằng enzym EcoRI.
- Trình tự enzym EcoRI 5’……GAATTC……3’ 3’……CTTAAG……5’ - Thành phần phản ứng: EcoRI 0,3µl Buffer 1µl DNA 3µl Nước khử ion 5,7µl
- Quá trình cắt được thực hiện ở 37oC qua đêm.
2.3.7. Xác định trình tự nucleotid của đoạn gen đã tách dòng
Tiến hành theo phương pháp tổng hợp của Sanger và cộng sự.
Thực hiện phản ứng PCR ngoài các thành phần thông thường còn bổ sung thêm loại dideoxynuceotid (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) đã được đánh dấu bằng thuốc nhuộm huỳnh quang.
Điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamid có bổ sung ure làm tăng khả năng phân giải của gen. Dùng tia laze quét để phát hiện dideoxynucleotid đánh dấu.
Xử lý kết quả bằng phần mềm PC/GENE, sau đó tiến hành so sánh trình tự gen đã tách dòng với các trình tự đã công bố trong Ngân hàng Gen quốc tế.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis mang gen cry1Ab, cry1Ac có hoạt tính diệt côn trùng bộ cánh vảy
3.1.1. Đặc điểm hình thái của Bacillus thuringiensis
Từ các chủng vi sinh vật thu nhận được từ phòng Di truyền Vi sinh vật.
Chúng tôi tiến hành nuôi cấy trên môi trường MPA và ủ ở nhiệt độ 280
C. Sau
3 ngày nuôi cấy trên bề mặt môi trường xuất hiện các khuẩn lạc Bt. Khuẩn lạc
Bt là những khuẩn lạc: tròn, có màu trắng sữa, có mép nhăn hoặc không.
Mỗi đĩa nuôi tách 3 khuẩn lạc riêng rẽ, đặc trưng cho nhóm Bc – Bt để quan sát dưới kính hiển vi quang học ở vật kính dầu, tiêu bản nhuộm đơn với
Fushin. Qua đó lựa chọn được các chủng Bt có khả năng hình thành bào tử và
tinh thể.
Hình 3.1. Hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn Bt trên môi trƣờng MPA sau 72 giờ nuôi cấy ở 280
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.1.2. Hình dạng tinh thể của các chủng Bt
Các protein tinh thể của Bt có 4 dạng: hình lưỡng tháp, hình ovan, hình lập phương và hình không xác định. Các chủng khác nhau có khả năng sinh ra tinh thể có hình dạng khác nhau.
Bằng phương pháp quan sát sơ bộ trực tiếp trên kính hiển vi quang học ở vật kính dầu với tiêu bản nhuộm đơn bằng fushin, chúng tôi tiến hành phân
loại hình dạng tinh thể cho các chủng Bt phân lập (bảng 3.1)
Bảng 3.1. Sự phân bố hình dạng tinh thể của các chủng Bacillus thuringiensis
STT Hình dạng Số chủng Tỉ lệ (%) 1 Hình lưỡng tháp 14 50 2 Hình cầu 7 25 3 Hình cầu, hình lưỡng tháp 5 17,8 4 Hình lập phương, hình cầu 1 3,6 5 Cầu-Lưỡng tháp-Lập phương 1 3,6
Từ số liệu thống kê ở bảng 1 ta thấy các chủng Bt phân lập đều sinh tinh
thể, trong đó các chủng sinh tinh thể hình lưỡng tháp chiếm ưu thế (50%).
Ngoài ra ta thấy còn có các chủng Bt sinh ra 2 loại tinh thể (21,4%) và 3 loại
tinh thể (3,6%). Điều này thể hiện tính đa dạng về hình dạng tinh thể của chủng Bt phân lập tại Thái Nguyên và qua đó cho thấy Bt có phổ diệt côn trùng rộng từ côn trùng bộ cánh vảy, bộ cánh cứng, bộ hai cánh tới giun tròn thực vật.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.1.3. Phân loại Bt bằng phƣơng pháp huyết thanh
Vi khuẩn Bt được chia làm rất nhiều dưới loài khác nhau, mỗi dưới loài
mang các đặc điểm riêng biệt. Dưới loài Bt. var. kustaki có khả năng diệt côn trùng bộ cánh vảy thuộc typ huyết thanh H3a, 3b,3c
Với kit huyết thanh miễn dịch chuẩn nhận từ phòng Di truyền Vi sinh vật chúng tôi tiến hành sàng lọc các chủng Bt. var. kustaki bằng cách sử dụng typ huyết thanh H3a, 3b, 3c
Với phương pháp phân loại được trình bày ở phần 2.3.3, kết quả là 21 trên tổng số 28 chủng nghiên cứu được khẳng định thuộc dưới loài kustaki
thông qua phản ứng ngưng kết với typ huyết thanh H3a, 3b,3c. Các chủng này
được chúng tôi tiến hành tách plasmid để phát hiện gen cry1Ab và gen cry1Ac
bằng phương pháp PCR
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.1..4. Phát hiện gen cry1Ab, cry1Ac ở các chủng Bt var. kustaki bằng phƣơng pháp PCR
Nhóm gen mã hóa protein Cry1Ab và Cry1Ac đã và đang được các nhà
khoa học quan tâm nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn. Protein tinh thể độc tố của nhóm gen này có tác dụng với nhiều loài côn trùng bộ cánh vẩy. Gen
cry1Ab, cry1Ac phát hiện thuộc một trong các dưới loài được trình bày ở mục 1.2.6.5 phần Tổng quan tài liệu, trong đó dưới loài Bacillus thuringiensis var.
kurstaki mang cả hai loại gen cry1Ab, cry1Ac mã hóa tinh thể độc tố Cry1Ab, Cry1Ac có hoạt tính diệt sâu tơ thuộc bộ cánh vẩy. Để phát hiện các gen độc
tố này, chúng tôi sử dụng phương pháp PCR để khuếch đại cặp gen cry1Ab,
cry1Ac với các cặp mồi đặc hiệu của chúng. Theo tính toán lí thuyết, đoạn gen
cry1Ab sau khi tổng hợp với cặp mồi đặc hiệu sẽ thu được sản phẩm có chiều
dài 238bp và đoạn gen cry1Ac là 487bp. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra
trên gel agarose 1% (Hình 3.4).
Hình 3.3. Hình ảnh ngƣng kết của chủng Btk 3.4TN (1) và chủng đối chứng 4D4(2) với typ huyết H3a,3b,3c dƣới kính hiển vi quang học
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 3.2. Bảng kết quả các chủng Baccillus thuringiensis var kustaki mang gen STT Tên chủng Gen 1 DT1.3.1 cry1Ab cry1Ac 2 36.8TN cry1Ab cry1Ac 3 2.5TN cry1Ab cry1Ac 4 5.15TN cry1Ab cry1Ac 5 3.4TN cry1Ab cry1Ac 6 6.8TN cry1Ab cry1Ac 7 TC9.1 cry1Ab cry1Ac 8 TC1.5 cry1Ab cry1Ac 9 TC3.6 cry1Ab cry1Ac 10 4.4TN cry1Ac 11 6.3TN cry1Ac 12 TrC2.3 cry1Ac 13 TD4.5 cry1Ac 14 TrC5.4 cry1Ac
Kết quả phát hiện gen cry1Ab và cry1Ac từ 21 chủng cho thấy 14 chủng mang
gen, trong đó , có 9/21 chủng (42,8%) mang gen cry1Ab, 14/21 chủng
(66,67%) mang gen cry1Ac và 7/21 chủng (33,33%) không mang gen nào .
Trong số các chủng mang gen , có 9/14 chủng (64,2%) mang cả 2 gen cry1Ab
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
cũng như hình thái tinh thể chúng tôi lựa chọn 6 chủng Baccillus thuringiensis
var kustaki có khả năng sinh 2 hoặc 3 loại tinh thể đồng thời mang cả 2 gen cho các nghiên cứu tiếp theo .
3.1.5. Thử hoạt tính sinh học của các chủng Bt. var. kustaki phân lập
3.1.5.1. Xác định nồng độ bào tử
Từ 9 chủng Bt. var. Kustaki mang cả 2 gen cry1Ab và cry1Ac chúng tôi lựa chọn ra 6 chủng sinh 2 hoặc 3 loại tinh thể để thử hoạt tính đối với sâu tơ.Trước khi tiến hành thử hoạt tính diệt sâu thì các chủng Bacillus thuringiensis được xác định số lượng bào tử và tinh thể. Sau 72 giờ đến 96 giờ nuôi cấy ở 280C tiến hành đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa có chứa môi trường MPA. Từ số lượng khuẩn lạc xuất hiện suy ra số bào tử trong 1ml dịch nuôi cấy như đã trình bày ở phần phương pháp.
Chúng tôi đã xác định được nồng độ bào tử. Nồng độ bào tử của các
chủng dao động trong khoảng 1.109
– 1,5.1010. Để tiện cho việc thử hoạt tính
của chúng tôi pha loãng tất cả các chủng tới nồng độ 1.109
bào tử/ml. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 487 bp 238 bp
Hình 3.4 . Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% 1-6 (cry1Ab): DT1.3.10, 36.8TN, DT1.3.1, 5.15TN, 3.4TN, 6.8TN
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.1.5.2. Thử nghiệm hoạt tính diệt sâu tơ (Plutella xylostella) của các chủng Bt. var. kustaki phân lập chủng Bt. var. kustaki phân lập
Các chủng Bt phân lập được pha loãng tới nồng độ 1.105 và 1.107 bt/ml bằng nước cất vô trùng. Thử nghiệm theo phương pháp nhúng đĩa lá của Thiery và Frachon như đã trình bày ở phần vật liệu và phương pháp nghiên cứu. Tỷ lệ sâu chết được theo dõi trong 3 ngày Kết quả thử nghiệm được trình bày trong bảng sau:
Bảng 3.3. Kết quả thử hoạt tính diệt sâu tơ sau 3 ngày thử nghiệm
STT Tên chủng
Tỷ lệ sâu chết (%)
Sau 2 ngày Sau 3 ngày
105 bào tử/ml 107 bào tử/ml 105 bào tử/ml 107 bào tử/ml 1 Đối chứng 0 0 0 0 2 DT1.3.1 6,25 12,50 75 75 3 36.8TN 18,80 25 81,25 87,50 4 2.5TN 18,80 25 81,25 100 5 5.15TN 12,50 18,80 62,50 75 6 3.4TN 18,80 25 93,75 100 7 6.8TN 18,80 31,20 81,25 87,50
Từ kết quả trên ta thấy, các chủng Bt var. kustaki phân lập có hiệu lực
diệt sâu tơ cao. Sau 72 giờ thử hoạt tính ở nồng độ 107
bào tử/ml, có 4 chủng diệt được 80 – 100% số sâu. Không có chủng nào có hoạt tính diệt sâu dưới
75%. như vậy ở nồng độ 107 bào tử/ml thì hoạt tính diệt sâu của các chủng Bt
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
cao. Vì vậy việc sàng lọc được các chủng Bt có hoạt tính diệt sâu cao là rất có ý nghĩa. Các chủng này cần phải được giữ lại để nghiên cứu kỹ hơn
3.2. Tách dòng và đọc trình tự gen cry1Ab và cry1Ac
Bằng phương pháp PCR chúng tôi đã phát hiện 9 chủng Bt. var. Kustaki
nghiên cứu mang cả 2 gen cry1Ab và cry1Ac. Để khẳng định các chủng này
có chắc chắn mang gen cry1Ab và gen cry1Ac hay không bước tiếp theo chúng tôi chọn ngẫu nhiên ba chủng 3.4TN, 36.8TN và 6.8TN để tiến hành tách dòng và xác định trình tự của chúng.
3.2.1. Tách dòng gen cry1Ab, cry1Ac
3.2.1.1. Gắn sản phẩm PCR vào vectơ tách dòng pGEM-T Easy
Vectơ pGEM-T Easy tồn tại ở dạng mạch thẳng với 2 đầu tự do mỗi đầu thừa ra một nucleotid T nên dễ dàng bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung với đầu
so le A của sản phẩm PCR sử dụng Taq polymerase vì thế chúng tôi lựa chọn