Vectơ tách dòng (vector cloning) là một trình tự DNA có kích thước nhỏ cho phép cài (gắn) các đoạn DNA cần thiết, có khả năng tái bản không phụ thuộc vào sự phân chia của tế bào, tồn tại trong tế bào chủ trong nhiều thế hệ không gây biến đổi bộ gen của tế bào vật chủ [1,8,9].
Tùy thuộc vào kích thước đoạn DNA muốn tạo dòng và mục đích tạo dòng mà chọn lọc vectơ tách dòng thích hợp. Thông thường với các đoạn DNA không quá lớn (dưới 10kb) thì plasmid là vectơ tách dòng được sử dụng nhiều nhất và tế bào tiếp nhận là vi khuẩn. Một trong những vectơ tạo dòng nhân tạo thuộc thế hệ mới nhất và được sử dụng phổ biến hiện nay là vectơ pGEM-T Easy. Vectơ này mang đầy đủ những đặc điểm của một vectơ tách dòng [24,26]:
Đầu lồi thymidine 3’ cho phép dễ dàng PCR cloning: Các vectơ pGEM-T Easy được thiết kế với một đầu lồi 3’- thymidine. T-nhô ra ở vị trí
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
gắn tăng hiệu quả của quá trình gắn sản phẩm PCR bằng cách ngăn chặn việc tự gắn vòng của vectơ và cung cấp một đầu T tương thích với đầu A của sản phẩm PCR đã được tạo ra bởi các enzym tổng hợp.
Lựa chọn các thể chuyển nạp xanh / trắng: Vectơ pGEM-T Easy là vectơ có số lượng bản copy cao, chứa các promoter T7 và RNA polymerase nằm cạnh vùng MCR (multiple cloning region), bên trong có chứa đoạn mã cho α-peptite và enzym β-galactosidase. Khi gen mục tiêu được chèn vào vectơ làm bất hoạt enzym β-galactosidase, đây là cơ sở cho việc lựa chọn khuẩn lạc xanh trắng.
Có nhiều vị trí cắt cho enzym giới hạn: Vectơ pGEM-T Easy chứa một số lượng lớn vị trí cắt của các enzym giới hạn trong vùng đa chọn lọc MCR. Vùng MCR của vectơ pGEM-T Easy gồm các vị trí nhận biết của enzym
EcoRI, BstZI và NotI, cho phép 3 enzym có thể cắt các đoạn chèn vào một cách độc lập.
Gắn nhanh chóng: vectơ pGEM-T Easy được cung cấp với đệm 2x rapid ligation buffer. Phản ứng gắn thường được ủ trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng (tốt nhất là để qua đêm).
Các trình tự và vị trí nhân dòng của vectơ PGEM-T Easy.
Vectơ pGEM-T Easy có thể được làm thẳng ở vị trí base thứ 60 bằng
enzym EcoRV và thêm một base T vào đầu 3’. Vị trí cắt của EcoRV sẽ được
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 1.2. Thành phần chính của plasmid pGEM – T Easy
Thành phần Vị trí
Điểm khởi đầu phiên mã T7 RNA polymerase 1
Trình tự đa cắt nối 10 – 128
SP6 RNA polymeraza promoter (-17 đến 3) 139 – 158
Điểm khởi đầu phiên mã SP6 RNA polymerase 141
Vị trí bám mồi pUC / M13 ngược 176 – 197
Bộ ba mở đầu gen lacZ 180
Lac operator 200 – 216
Vùng mã hóa β-lactamase 1337 – 2197
Gen kháng ampicillin 1338 – 2198
F1 ori 2513 – 2819
Vùng mã hóa lac operon 2836 – 2996, 166 – 395
Vị trí bám mồi pUC / M13 xuôi 2941 – 2957
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP