Các protein tinh thể của Bt có 4 dạng: hình lưỡng tháp, hình ovan, hình lập phương và hình không xác định. Các chủng khác nhau có khả năng sinh ra tinh thể có hình dạng khác nhau.
Bằng phương pháp quan sát sơ bộ trực tiếp trên kính hiển vi quang học ở vật kính dầu với tiêu bản nhuộm đơn bằng fushin, chúng tôi tiến hành phân
loại hình dạng tinh thể cho các chủng Bt phân lập (bảng 3.1)
Bảng 3.1. Sự phân bố hình dạng tinh thể của các chủng Bacillus thuringiensis
STT Hình dạng Số chủng Tỉ lệ (%) 1 Hình lưỡng tháp 14 50 2 Hình cầu 7 25 3 Hình cầu, hình lưỡng tháp 5 17,8 4 Hình lập phương, hình cầu 1 3,6 5 Cầu-Lưỡng tháp-Lập phương 1 3,6
Từ số liệu thống kê ở bảng 1 ta thấy các chủng Bt phân lập đều sinh tinh
thể, trong đó các chủng sinh tinh thể hình lưỡng tháp chiếm ưu thế (50%).
Ngoài ra ta thấy còn có các chủng Bt sinh ra 2 loại tinh thể (21,4%) và 3 loại
tinh thể (3,6%). Điều này thể hiện tính đa dạng về hình dạng tinh thể của chủng Bt phân lập tại Thái Nguyên và qua đó cho thấy Bt có phổ diệt côn trùng rộng từ côn trùng bộ cánh vảy, bộ cánh cứng, bộ hai cánh tới giun tròn thực vật.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.1.3. Phân loại Bt bằng phƣơng pháp huyết thanh
Vi khuẩn Bt được chia làm rất nhiều dưới loài khác nhau, mỗi dưới loài
mang các đặc điểm riêng biệt. Dưới loài Bt. var. kustaki có khả năng diệt côn trùng bộ cánh vảy thuộc typ huyết thanh H3a, 3b,3c
Với kit huyết thanh miễn dịch chuẩn nhận từ phòng Di truyền Vi sinh vật chúng tôi tiến hành sàng lọc các chủng Bt. var. kustaki bằng cách sử dụng typ huyết thanh H3a, 3b, 3c
Với phương pháp phân loại được trình bày ở phần 2.3.3, kết quả là 21 trên tổng số 28 chủng nghiên cứu được khẳng định thuộc dưới loài kustaki
thông qua phản ứng ngưng kết với typ huyết thanh H3a, 3b,3c. Các chủng này
được chúng tôi tiến hành tách plasmid để phát hiện gen cry1Ab và gen cry1Ac
bằng phương pháp PCR
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.1..4. Phát hiện gen cry1Ab, cry1Ac ở các chủng Bt var. kustaki bằng phƣơng pháp PCR
Nhóm gen mã hóa protein Cry1Ab và Cry1Ac đã và đang được các nhà
khoa học quan tâm nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn. Protein tinh thể độc tố của nhóm gen này có tác dụng với nhiều loài côn trùng bộ cánh vẩy. Gen
cry1Ab, cry1Ac phát hiện thuộc một trong các dưới loài được trình bày ở mục 1.2.6.5 phần Tổng quan tài liệu, trong đó dưới loài Bacillus thuringiensis var.
kurstaki mang cả hai loại gen cry1Ab, cry1Ac mã hóa tinh thể độc tố Cry1Ab, Cry1Ac có hoạt tính diệt sâu tơ thuộc bộ cánh vẩy. Để phát hiện các gen độc
tố này, chúng tôi sử dụng phương pháp PCR để khuếch đại cặp gen cry1Ab,
cry1Ac với các cặp mồi đặc hiệu của chúng. Theo tính toán lí thuyết, đoạn gen
cry1Ab sau khi tổng hợp với cặp mồi đặc hiệu sẽ thu được sản phẩm có chiều
dài 238bp và đoạn gen cry1Ac là 487bp. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra
trên gel agarose 1% (Hình 3.4).
Hình 3.3. Hình ảnh ngƣng kết của chủng Btk 3.4TN (1) và chủng đối chứng 4D4(2) với typ huyết H3a,3b,3c dƣới kính hiển vi quang học
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 3.2. Bảng kết quả các chủng Baccillus thuringiensis var kustaki mang gen STT Tên chủng Gen 1 DT1.3.1 cry1Ab cry1Ac 2 36.8TN cry1Ab cry1Ac 3 2.5TN cry1Ab cry1Ac 4 5.15TN cry1Ab cry1Ac 5 3.4TN cry1Ab cry1Ac 6 6.8TN cry1Ab cry1Ac 7 TC9.1 cry1Ab cry1Ac 8 TC1.5 cry1Ab cry1Ac 9 TC3.6 cry1Ab cry1Ac 10 4.4TN cry1Ac 11 6.3TN cry1Ac 12 TrC2.3 cry1Ac 13 TD4.5 cry1Ac 14 TrC5.4 cry1Ac
Kết quả phát hiện gen cry1Ab và cry1Ac từ 21 chủng cho thấy 14 chủng mang
gen, trong đó , có 9/21 chủng (42,8%) mang gen cry1Ab, 14/21 chủng
(66,67%) mang gen cry1Ac và 7/21 chủng (33,33%) không mang gen nào .
Trong số các chủng mang gen , có 9/14 chủng (64,2%) mang cả 2 gen cry1Ab
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
cũng như hình thái tinh thể chúng tôi lựa chọn 6 chủng Baccillus thuringiensis
var kustaki có khả năng sinh 2 hoặc 3 loại tinh thể đồng thời mang cả 2 gen cho các nghiên cứu tiếp theo .
3.1.5. Thử hoạt tính sinh học của các chủng Bt. var. kustaki phân lập
3.1.5.1. Xác định nồng độ bào tử
Từ 9 chủng Bt. var. Kustaki mang cả 2 gen cry1Ab và cry1Ac chúng tôi lựa chọn ra 6 chủng sinh 2 hoặc 3 loại tinh thể để thử hoạt tính đối với sâu tơ.Trước khi tiến hành thử hoạt tính diệt sâu thì các chủng Bacillus thuringiensis được xác định số lượng bào tử và tinh thể. Sau 72 giờ đến 96 giờ nuôi cấy ở 280C tiến hành đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa có chứa môi trường MPA. Từ số lượng khuẩn lạc xuất hiện suy ra số bào tử trong 1ml dịch nuôi cấy như đã trình bày ở phần phương pháp.
Chúng tôi đã xác định được nồng độ bào tử. Nồng độ bào tử của các
chủng dao động trong khoảng 1.109
– 1,5.1010. Để tiện cho việc thử hoạt tính
của chúng tôi pha loãng tất cả các chủng tới nồng độ 1.109
bào tử/ml. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 487 bp 238 bp
Hình 3.4 . Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% 1-6 (cry1Ab): DT1.3.10, 36.8TN, DT1.3.1, 5.15TN, 3.4TN, 6.8TN
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.1.5.2. Thử nghiệm hoạt tính diệt sâu tơ (Plutella xylostella) của các chủng Bt. var. kustaki phân lập chủng Bt. var. kustaki phân lập
Các chủng Bt phân lập được pha loãng tới nồng độ 1.105 và 1.107 bt/ml bằng nước cất vô trùng. Thử nghiệm theo phương pháp nhúng đĩa lá của Thiery và Frachon như đã trình bày ở phần vật liệu và phương pháp nghiên cứu. Tỷ lệ sâu chết được theo dõi trong 3 ngày Kết quả thử nghiệm được trình bày trong bảng sau:
Bảng 3.3. Kết quả thử hoạt tính diệt sâu tơ sau 3 ngày thử nghiệm
STT Tên chủng
Tỷ lệ sâu chết (%)
Sau 2 ngày Sau 3 ngày
105 bào tử/ml 107 bào tử/ml 105 bào tử/ml 107 bào tử/ml 1 Đối chứng 0 0 0 0 2 DT1.3.1 6,25 12,50 75 75 3 36.8TN 18,80 25 81,25 87,50 4 2.5TN 18,80 25 81,25 100 5 5.15TN 12,50 18,80 62,50 75 6 3.4TN 18,80 25 93,75 100 7 6.8TN 18,80 31,20 81,25 87,50
Từ kết quả trên ta thấy, các chủng Bt var. kustaki phân lập có hiệu lực
diệt sâu tơ cao. Sau 72 giờ thử hoạt tính ở nồng độ 107
bào tử/ml, có 4 chủng diệt được 80 – 100% số sâu. Không có chủng nào có hoạt tính diệt sâu dưới
75%. như vậy ở nồng độ 107 bào tử/ml thì hoạt tính diệt sâu của các chủng Bt
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
cao. Vì vậy việc sàng lọc được các chủng Bt có hoạt tính diệt sâu cao là rất có ý nghĩa. Các chủng này cần phải được giữ lại để nghiên cứu kỹ hơn
3.2. Tách dòng và đọc trình tự gen cry1Ab và cry1Ac
Bằng phương pháp PCR chúng tôi đã phát hiện 9 chủng Bt. var. Kustaki
nghiên cứu mang cả 2 gen cry1Ab và cry1Ac. Để khẳng định các chủng này
có chắc chắn mang gen cry1Ab và gen cry1Ac hay không bước tiếp theo chúng tôi chọn ngẫu nhiên ba chủng 3.4TN, 36.8TN và 6.8TN để tiến hành tách dòng và xác định trình tự của chúng.
3.2.1. Tách dòng gen cry1Ab, cry1Ac
3.2.1.1. Gắn sản phẩm PCR vào vectơ tách dòng pGEM-T Easy
Vectơ pGEM-T Easy tồn tại ở dạng mạch thẳng với 2 đầu tự do mỗi đầu thừa ra một nucleotid T nên dễ dàng bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung với đầu
so le A của sản phẩm PCR sử dụng Taq polymerase vì thế chúng tôi lựa chọn
vectơ pGEM-T Easy làm vectơ tách dòng. Các đoạn đoạn gen tính toán theo
Hình 3.5. Hình ảnh thử hoạt tính diệt sâu tơ (Plutella xylostella) của các chủng Bt nghiên cứu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
lý thuyết lần lượt là 238 bp và 487bp thu được từ phản ứng PCR của 3 chủng được gắn trực tiếp vào vectơ pGEM-T Easy bằng enzym T4- ligaza ở 40
C. Sản phẩm là vectơ tái tổ hợp pGEM-T Easy – cry1Ab – 3.4TN; pGEM-T Easy – cry1Ab – 36.8TN; pGEM-T Easy – cry1Ab – 6.8TN; pGEM-T Easy – cry1Ac – 3.4TN; pGEM-T Easy – cry1Ac – 36.8TN; pGEM-T Easy – cry1Ac – 6.8TN.
3.2.1.2. Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào vi khuẩn E. coli DH5α
Để biến nạp vectơ vào vi khuẩn E.coli chúng tôi tiến hành tạo tế bào khả
biến như đã trình bày tại mục 2.3.6.2 sau đó biến nạp sản phẩm lai vào tế bào khả biến theo phương pháp sốc nhiệt. Sản phẩm lai được biến nạp vào loài
E.coli chủng DH5α và cấy trải trên môi trường LBA có bổ sung ampicillin và
Xgal ở 37o
C, sau 14 – 16 giờ thấy xuất hiện các khuẩn lạc xanh trắng. Những
khuẩn lạc màu trắng là những khuẩn lạc có khả năng mang gen cry1Ab hoặc
gen cry1Ac (hình 4.6). Khuẩn lạc xanh Khuẩn lạc trắng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Các khuẩn lạc trắng được cấy vào môi trường LB lỏng để tách DNA plasmide tiÕn hµnh t¸ch chiÕt ADN plasmid vµ kiÓm tra plasmid t¸i tæ hîp b»ng ®iÖn di trªn gel agarose 1%. KÕt qu¶ thÓ hiÖn h×nh 3.7:
Theo lí thuyết điện di , DNA kích thước lớn hơn sẽ chạy chậm hơn nghĩa là ảnh quan sát được vạch sáng cao hơn do đó , đây có khả năng là các plasmid tái tổ hợp chứa gen quan tâm . Do vậy, trong hình A , DNA plasmid của các dòng khuẩn lạc 1-3,5,7-11 có khả năng là những plasmid tái tổ hợp mang gen
cry1Ab. Ngoài ra, trong hình B , DNA plasmid của các dòng 1,3,5,7,8,10 cũng
có khả năng là những plasmid chứa đoạn chèn 487 bp của gen cry1Ac. Để biết
được plasmid tái tổ hợp có mang gen mong muốn hay không , chúng tôi lựa
Hình 3.7. Điện di DNA plasmid của các dòng khuẩn lạc xanh, trắng A: pGEM T Esasy-cry1Ab-3.4TN
B: pGEM T Esasy-cry1Ac-3.4TN
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
chọn một số dòng plasmid để kiểm tra sự có mặt của gen cry1Ab và cry1Ac
bằng phương pháp cắt bằng enzyme giới hạn và phương pháp PCR .
3.2.1.3. Kiểm tra sự có mặt của gen cry1Ab, cry1Ac trong các dòng plasmid tái tổ hợp tái tổ hợp
Do trên vectơ tách dòng pGEM – T Easy có chứa vị trí cắt của enzym
EcoRI tiếp giáp với vùng đa cắt nối (vùng cho phép cài gắn các đoạn gen cần
tách dòng) nên chúng tôi sử dụng enzym EcoRI để kiểm tra và đảm bảo quá
trình tách dòng đã thực hiện thành công với vectơ tái tổ hợp pGEM – T Easy-
cry1Ab và pGEM – T Easy-cry1Ac. Sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose 0,8%.
Kết quả được thể hiện tại hình sau:
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 300 200 500 300 238 3015 487 3015 bp bp bp bp
Hình 3.8 điện di sản phẩm cắt DNA plasmid
A. pGEM T Easy-cry1Ab-3.4TN B. pGEM T Easy-cry1Ac-3.4TN 1. Thang DNA chuẩn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Kết quả cho thấy ở hình A, DNA plasmid của các dòng khuẩn lạc trắng
sau khi cắt bằng enzym giới hạn EcoRI tạo ra hai băng, băng lớn là vectơ tách
dòng pGEM-T Easy có kích thước khoảng 3000 bp, băng nhỏ có kích thước là
gần 300 bp tương ứng với sản phẩm PCR của gen cry1Ab (238bp). Trong khi
đó, sản phẩm cắt từ các dòng khuẩn lạc xanh chỉ cho một băng duy nhất có kích thước khoảng 3000bp là kích thước của vector. Ở hình B, DNA plasmid
của các dòng khuẩn lạc trắng sau khi cắt bằng enzym giới hạn EcoRI cũng tạo
ra hai băng, băng lớn là vectơ tách dòng pGEM-T Easy có kích thước khoảng 3000 bp, băng nhỏ có kích thước là gần 500 bp tương ứng với sản phẩm PCR
của gen cry1Ac (487bp). Như vậy, có thể kết luận rằng các dòng nghiên cứu
đã được biến nạp thành công mang vectơ tách dòng pGEM-T Easy, và quá trình tách dòng không ảnh hưởng đến vị trí cắt của enzyme giới hạn trong hai mồi
Để có kết luận chính xác hơn về plasmid tái tổ hợp có mang đoạn gen
cry1Ab, cry1Ac hay không chúng tôi tiến hành PCR với khuôn DNA là plasmid tái tổ hợp trên. Kết quả được thể hiện trong hình sau:
1 2 3 4 1 2 3 4 2 3 4 238 bp bp 300 bp bp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Từ những kết quả thu được ở trên, chúng tôi có thể bước đầu kết luận là
đã tách dòng thành công gen cry1Ab và gen cry1Ac trong vectơ pGEM-T
Easy. Tuy nhiên, để có thể kết luận chính xác đoạn gen đã tách dòng có phải là gen cry1Ab, cry1Ac hay không chúng tôi tiến hành đọc trình tự các đoạn gen này và so sánh với các trình tự gen đã đăng ký trong Ngân hàng Gen quốc tế bằng những phần mềm chuyên dụng.
3.2.2. Xác định trình tự đoạn gen cry1Ab và cry1Ac 3.2.2.1. Xác định trình tự đoạn gen cry1Ab 3.2.2.1. Xác định trình tự đoạn gen cry1Ab
Plasmid tái tổ hợp pGEM -T Easy-cry1Ab-3.4TN-p3, pGEM-T Easy-
cry1Ab-36.8TN-p5 và pGEM-T Easy-cry1Ab-6.8TN-p1 được chọn để đọc trình tự . Kết quả thể hiện trên hình 3.10 cho thấy đoạn gen cry1Ab của 3 chủng 3.4TN, 36.8TN và 6.8TN có kích thước 238 nucleotide, có độ tương đồng 99% so với 2 trình tự có mã số DQ241675.1 và EF220269.1 trên ngân
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.4TN có 1 sự thay đổi so với 2 trình tự trên (232: T thành C ). Trình tự đoạn gen cry1Ab của chủng 6.8TN có 2 sự thay đổi so với 2 trình tự trên (169: T thành A, 194: A thành C ), Đây là đoạn đặc hiệu của gen cry1Ab mã hóa tổng
hợp potein endo toxin Cry 1Ab của chủng Bacillus thuringiensis Btc008
(DQ241675.1) và Bacillus thuring BtS2491Ab
10 20 30 40 50 60 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 3.4TN-1Ab-p3 TCGAATTGAA TTTGTTCCGG CAGAAGTAAC CTTTGAGGCA GAATATGATT TAGAAAGAGC 36.8TN-1Ab-p5 TCGAATTGAA TTTGTTCCGG CAGAAGTAAC CTTTGAGGCA GAATATGATT TAGAAAGAGC 6.8TN-1Ab-p1 TCGAATTGAA TTTGTTCCGG CAGAAGTAAC CTTTGAGGCA GAATATGATT TAGAAAGAGC DQ241675.1 TCGAATTGAA TTTGTTCCGG CAGAAGTAAC CTTTGAGGCA GAATATGATT TAGAAAGAGC EF683163.1 TCGAATTGAA TTTGTTCCGG CAGAAGTAAC CTTTGAGGCA GAATATGATT TAGAAAGAGC 70 80 90 100 110 120 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
3.4TN-1Ab-p3 ACAAAAGGCG GTGAATGAGC TGTTTACTTC TTCCAATCAA ATCGGGTTAA AAACAGATGT
36.8TN-1Ab-p5 ACAAAAGGCG GTGAATGAGC TGTTTACTTC TTCCAATCAA ATCGGGTTAA AAACAGATGT
6.8TN-1Ab-p1 ACAAAAGGCG GTGAATGAGC TGTTTACTTC TTCCAATCAA ATCGGGTTAA AAACAGATGT
DQ241675.1 ACAAAAGGCG GTGAATGAGC TGTTTACTTC TTCCAATCAA ATCGGGTTAA AAACAGATGT
EF683163.1 ACAAAAGGCG GTGAATGAGC TGTTTACTTC TTCCAATCAA ATCGGGTTAA AAACAGATGT
130 140 150 160 170 180 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 3.4TN-1Ab-p3 GACGGATTAT CATATTGATC AAGTATCCAA TTTAGTTGAG TGTTTATCTG ATGAATTTTG 36.8TN-1Ab-p5 GACGGATTAT CATATTGATC AAGTATCCAA TTTAGTTGAG TGTTTATCTG ATGAATTTTG 6.8TN-1Ab-p1 GACGGATTAT CATATTGATC AAGTATCCAA TTTAGTTGAG TGTTTATCAG ATGAATTTTG DQ241675.1 GACGGATTAT CATATTGATC AAGTATCCAA TTTAGTTGAG TGTTTATCTG ATGAATTTTG EF683163.1 GACGGATTAT CATATTGATC AAGTATCCAA TTTAGTTGAG TGTTTATCTG ATGAATTTTG 190 200 210 220 230 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|..
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
36.8TN-1Ab-p5 TCTGGATGAA AAAAAAGAAT TGTCCGAGAA AGTCAAACAT GCGAAGCGAC TCAGTGA
6.8TN-1Ab-p1 TCTGGATGAA AAACAAGAAT TGTCCGAGAA AGTCAAACAT GCGAAGCGAC TCAGTGA