SẢN PHẨM
3.3.1. Đề xuất qui trình thu nhận fucoidan từ rong nâu
Hình 3.13. Qui trình sản xuất fucoidan
Alginate, bã rong Hợp chất PTL lớn
Loại acid alginic
Lọc vải thô
Lọc cát và than hoạt tính Lọc qua cột nhựa cationit Xay (rong/nước=1/15, 900C, 50 phút, pH=8) Kết tủa Ly tâm Sấy kết tủa Fucoidan tinh San hô, tạp chất Đất cát Rong nâu Phân loại Rửa 1 Rửa 2 Phơi khô Ngâm Nước máy Muối, màu 2 giờ EtOH (960) Dịch/cồn = 1/2
CaCl2 Trung hòa
Alginate, bã rong Hợp chất PTL lớn
Thuyết minh quy trình
Rong nâu: là loại rong tươi, lấy ở biển Hòn Chồng – Nha Trang, là hỗn hợp
nhiều loại rong nâu. Rong đạt tiêu chuẩn về độ trưởng thành, tùy loài mà có chuẩn về kích thước, màu sắc, độ to của phao.
Phân loại: nhằm loại bỏ phần rong bị dập, mềm, biến đen, độ nhớt tăng. Đảm bảo chất lượng rong đồng đều, cần loại bỏ rong tạp và tạp chất. Phân loại và chọn ra 3 loài rong nâu cần dùng để tiến hành thí nghiệm.
Rửa 1: Rửa bằng nước biển, thường khi lấy rong lên thì ta tiến hành rửa tại chỗ, nơi nước sạch và trong. Rửa phải đều tay, vuốt sạch rong, tránh dồn cục khi rửa để đảm bảo sạch rong. Loại bỏ đất cát, san hô và các tạp chất ngay ở công đoạn này. Sau khi rửa xong, rong được cho vào bao sạch và đưa lên bờ, chú ý giảm tiếp xúc với cát, tránh dính bám cát vào rong. Thời gian rửa nhanh, cần chuyển lên bờ để làm các công đoạn sau.
Rửa 2: Công đoạn này rửa bằng nước ngọt, dùng vòi nước cho chảy nhẹ và ngập rong, tiến hành rửa sạch, vuốt theo chiều cây rong, rửa qua 3 đến 4 lần nước ngọt để loại một phần muối dính bám vào rong và vi sinh vật trên cây rong. Trong công đoạn này nếu còn sót san hô hoặc các tạp chất thì cần loại bỏ ngay.
Ngâm: Sau khi rửa thì ngâm nước ngọt trong vòng 2 giờ, mục đích là để loại bỏ các chất màu, các muối và các hợp chất có trọng lượng phân tử thấp tan được vào trong nước có trong rong.
Phơi khô: rong sau khi rửa sạch và ngâm đủ 2 giờ thì tiến hành vớt rong ra và phơi rong. Rong được rải đều trên các giàn phơi. Cách 2 giờ thì trở mặt rong 1 lần nhằm tăng diện tích tiếp xúc với ánh nắng và lưu thông không khí tốt. Nếu trời nắng to thì chỉ cần phơi trong vòng 2 ngày. Vì khi đã tiếp xúc với nước ngọt thì rong rất nhanh bị nhão ra nên cần phơi rong vào những ngày nắng to để rong nhanh chóng khô tránh hư hỏng rong. Sau khi phơi khô thì rong nâu chuyển sang màu nâu đen, giòn, cứng. Sau đó thì cho vào bao, để ở nơi khô ráo thoáng mát và ở nhiệt độ thường để cân bằng độ ẩm.
Xay: đây là công đoạn quan trọng nhằm thu được fucoidan. Cho rong và nước máy vào nồi chiết theo tỷ lệ rong/nước là 1:15. Điều chỉnh pH của hỗn hợp nước và rong về pH=8 bằng dung dịch NaOH loãng. Nâng nhiệt nồi chứa rong đạt 900C. Tiến hành xay rong, chú ý giữ nhiệt 50 phút trong quá trình xay rong. Trong công
đoạn này các polysaccharide bị cắt thành mạch ngắn hơn, khối chất chiết trở nên loãng và linh động hơn. Điều này hoàn toàn thuận lợi cho công đoạn tách chiết tiếp theo.
Loại acid alginic: Trong rong nâu có rất nhiều hợp chất không phải là fucoidan cần được loại bỏ để thu được fucoidan sạch, một trong những hợp chất đó là acid alginic. Có một tính chất quan trọng của acid alginic là có khả năng tạo gel với ion kim loại hóa trị II, đặc biệt tạo gel bền với Ca2+ (kể cả canxi photphat, canxi clorua, canxi cacbonat, canxi xitrat). Hơn nữa gel tạo được lại không thuận nghịch với nhiệt. Vì vậy mục đích của việc thêm CaCl2 vào dịch rong trong khi nấu là để tạo ra kết tủa alginate canxi do phản ứng giữa alginic trong rong và canxi clorua cho vào. Hơn nữa, đặc tính của acid alginic là tạo thành gel, kết tủa mạnh trong môi trường acid (pH=2) hoặc kết hợp với ion calcium kết tủa mạnh trong môi trường trung tính, alginic acid kết tủa dưới dạng alginate canxi và kéo theo bã rong thành các hạt rắn tách hẳn khỏi nước, dịch chiết còn lại sẽ rất trong, polysaccharide chỉ còn fucoidan và laminaran. Nếu kết tủa alginic acid bằng calcium, kết tủa AlgCa (alginate calcium) sẽ kết chặt với bã rong thành khối bền vững, đồng thời các kết tủa sẽ hấp thụ mạnh anion và cation kim loại nặng có chứa trong dịch chiết do đặc tính của AlgCa.
Lọc vải thô: Sau khi đã tiến hành tủa alginate thì cần lọc qua vải để loại bỏ kết tủa và bã rong. Để thúc đẩy quá trình này diễn ra nhanh hơn thì có thể vắt dịch rong. Dịch lọc thu được sau đó cho vào dụng cụ chứa để đo thể tích, còn bã rong bao gồm cả alginate được loại bỏ ra ngoài.
Lọc qua cát và than hoạt tính: do lúc này trong dịch rong vẫn còn rất nhiều các chất có khối lượng phân tử lớn nằm lơ lửng như: bã rong, tạp chất... Để thu được fucoidan sạch cần phải loại bỏ chúng ra khỏi dịch rong. Lọc dịch qua cột cát và than hoạt tính nhằm giải quyết vấn đề đó. Cột cát và than sẽ giữ lại trên bề mặt của chúng các hợp chất có khối lượng phân tử lớn không cần thiết trong dịch rong và được loại bỏ ra ngoài, còn dịch lọc được thu lại và đi qua công đoạn tiếp theo.
Lọc qua cột nhựa trao đổi ion cationit: tại đây các ion canxi dư lại trong dịch rong sẽ được các hạt nhựa này giữ lại bởi các hạt nhựa này là các ion âm, chúng sẽ hút và giữ lại trên bề mặt chúng các ion dương là Ca2+. Đến một lúc nào đó các hạt nhựa sẽ bị no ion Ca2+, lúc này quá trình lọc sẽ không có hiệu quả. Vì vậy cần theo dõi thường xuyên quá trình lọc và thử xem hạt nhựa đã no hay chưa bằng cách hứng một ít dịch lọc và cho vào đó dung dịch Na2CO3. Lúc này nếu xuất hiện các kết tủa trắng
chứng tỏ trong dịch lọc đang còn tồn tại ion Ca2+đồng nghĩa với việc hạt nhựa đã no không còn có khả năng hấp thụ ion Ca2+ từ dịch lọc được nữa. Vì vậy phải tiến hành rửa các hạt nhựa qua dung dịch acid HCl loãng. Khi đó ion Ca2+ trên bề mặt các hạt nhựa sẽ đi ra do chúng tạo muối với Cl- trong dung dịch HCl. Như vậy đến công đoạn này các ion kim loại nặng không cần thiết đã bị loại bỏ ra ngoài.
Trung hòa: Trung hòa dịch lọc, đưa dịch lọc về pH=7, vì tại pH=7 thì fucoidan mới tủa triệt để trong cồn.
Kết tủa: Như đã biết cồn là một dung môi phân cực háo nước nên sử dụng chúng để kết tủa fucoidan. Trong dịch chiết lúc này còn chứa một phần laminaran chưa bị loại bỏ ra. Mà tính chất của laminaran là kết tủa trong cồn đến nồng độ 85% (v/v) trở lên (tức là sau khi tủa nồng độ cồn của dung dịch tổng thể là 85% (v/v)), còn fucoidan tủa trong khoảng nồng độ cồn là 65 - 70% (v/v). Tiến hành cho cồn 96% (v/v) vào dịch rong với tỉ lệ cồn/dịch là 2/1, lúc này nồng độ đo được bằng thiết bị đo độ cồn là 65% (v/v). Như vậy kết tủa thu được là fucoidan chứ không có laminaran. Sau đó quấy mạnh tay để cồn tiếp xúc với dịch làm cho quá trình kết tủa xảy ra nhanh hơn. Kết tủa có màu nâu, kết bông lớn, lắng xuống đáy.
Ly tâm: Sau khi thu được kết tủa thì để một thời gian cho kết tủa lắng xuống
đáy, sau đó tiến hành ly tâm, gạn lớp cồn phía trên đi (có thể dùng để chưng cất thu hồi cồn cao độ), còn kết tủa thì được thu lại.
Sấy kết tủa: Tiến hành sấy kết tủa trong tủ sấy ở nhiệt độ 500C và trong thời gian 18 giờ, sấy đến khi đạt độ khô giòn thì kết thúc, thu được sản phẩm fucoidan tinh.
3.3.2. Sản xuất thử và đánh giá hiệu quả thu fucoidan so với các quy trình hiện hành
Sau khi tối ưu hóa công đoạn xay chiết của quy trình mới và hoàn thiện quy trình, tiến hành sản xuất thử nghiệm trên 3 loài rong nâu S.mcclurei, S.polycystum, S.oligocystum theo quy trình xay chiết mới và quy trình đối chứng (qui trình tách chiết fucoidan bằng nước và CaCl2 của bản quyền EP0645143A1), tiến hành 6 mẫu thí nghiệm với 3 loài rong theo 2 qui trình, mỗi mẫu thí nghiệm sử dụng 1kg rong khô để thu nhận fucoidan. Các mẫu thí nghiệm đều lặp lại 3 lần, kết quả trung bình chung giữa các lần thí nghiệm. Sau khi thu nhận fucoidan tiến hành sấy khô đến trọng lượng không đổi và cân định lượng hàm lượng fucoidan thô. Sau đó, tiến hành định lượng fucoidan tinh khiết trong sản phẩm fucoidan thô bằng phương pháp 3(PP3) [27] và tính hiệu suất thu nhận fucoidan tinh khiết. Sau đó, tiến hành xác định sự có mặt của fucoidan trong 3
sản phẩm. Kết quả khối lượng fucoidan thu được của từng loài rong theo 2 quy trình được thể hiện trong bảng 3.14, bảng 3.15, bảng 3.16, hình 3.14 và hình 3.15.
Bảng 3.14. Hàm lượng fucoidan thô thu được từ rong nâu S.mcclurei, S.polycystum, S.oligocystum khi tách chiết theo qui trình đối chứng và qui trình mới (g/1 kg rong khô)
Sản phẩm fucoidan thô/1 kg rong khô (g) Qui trình
S.mcclurei S.polycystum S.oligocystum
Qui trình đối chứng 13,3 35,8 32,4
Qui trình mới 13,5 36,2 32,4
Bảng 3.15. Tỷ lệ fucoidan tinh khiết trong sản phẩm thô thu được khi tách chiết theo qui trình đối chứng và qui trình mới từ các mẫu rong nâu S.mcclurei, S.polycystum, S.oligocystum
Tỷ lệ fucoidan trong sản phẩm thô (%)
Quy trình
S.mcclurei S.polycystum S.oligocystum
Qui trình đối chứng 90,68 91,5 90,3
Qui trình mới 96,5 97,1 96,8
Bảng 3.16. Hiệu suất thu nhận fucoidan tinh khiết (%) khi tách chiết theo qui trình đối
chứng và qui trình mới từ các mẫu rong nâu S.mcclurei, S.polycystum, S.oligocystum
Hiệu suất thu nhận fucoidan tinh khiết (%)
Quy trình
S.mcclurei S.polycystum S.oligocystum
Qui trình đối chứng 90 90,74 90,58
Hình 3.14. Tỷ lệ fucoidan tinh khiết (% so với sản phẩm thô) thu được khi tách chiết
theo qui trình đối chứng và qui trình mới từ các mẫu rong nâu S.mcclurei, S.polycystum, S.oligocystum
Hình 3.15. Hiệu suất thu nhận fucoidan tinh khiết (%) khi tách chiết theo qui trình đối
Nhận xét:
Từ kết quả thu nhận fucoidan từ 3 loài rong nâu thu mẫu tại tỉnh Khánh Hòa theo quy trình đối chứng (qui trình tách chiết fucoidan bằng nước và CaCl2 theo bản quyền EP0645143A1) và quy trình xay chiết mới được trình bày trong bảng 3.14, bảng 3.15, bảng 3.16, hình 3.14 và hình 3.15, cho thấy tỷ lệ fucoidan tinh khiết trong sản phẩm fucoidan thô thu được theo quy trình chiết tách mới trên cả 3 loài rong S.mcclurei, S. polycystum, S.oligocystum cao hơn so với quy trình đối chứng. Chứng tỏ fucoidan thu được theo quy trình mới sạch hơn. Và hiệu suất thu nhận fucoidan tinh khiết theo quy trình chiết tách mới trên cả 3 loài rong S.mcclurei, S.polycystum, S.oligocystum cao hơn so với quy trình đối chứng. Vì qui trình xay chiết mới sử dụng các thông số thích hợp hơn và cải tiến công đoạn nấu chiết thành xay chiết. Qui trình xay chiết bổ sung thêm công đoạn xay rong làm phá vỡ cấu trúc rong nhanh hơn, các chất thoát ra nhanh hơn, dễ dàng hơn nên làm rút ngắn thời gian nấu, nhiệt độ nấu, nâng cao hiệu suất thu hồi fucoidan và đồng thời điều quan trọng nhất là giúp fucoidan giữ được hoạt tính sinh học do không bị tác động bởi thời gian nấu chiết lâu. Như vậy, tỷ lệ fucoidan tinh
khiết trong sản phẩm fucoidan thô và hiệu suất thu nhận fucoidan tinh khiết thu được
theo quy trình chiết tách mới mới trên cả 3 loài rong S.mcclurei, S.polycystum,
S.oligocystum cao hơn so với quy trình đối chứng.
Loài rong S.polycystum khi chiết suất với qui trình xay chiết mới cho sản phẩm fucoidan thô cao nhất là 36,2g/1kg rong khô, đạt hiệu suất thu nhận fucoidan cao nhất là 97,37% so với 2 loại rong nâu S.mcclurei, S.oligocystum và đạt hiệu suất thu nhận fucoidan tinh khiết cao nhất là 97,1% (so với fucoidan thô). Như vậy, trong 3 loài rong thí nghiệm thì loài rong S.polycystum cho hàm lượng fucoidan cao nhất và khi chiết
bằng phương pháp xay chiết mới cho hiệu suất tính theo fucoidan tinh và độ sạch của
fucoifan trên loài rong này cao nhất. Vì vậy, trong các loài rong nâu phổ biến tại
Khánh Hòa nên ứng dụng loài rong S.polycystum trong nuôi trồng và sản xuất fucoidan để thu được hiệu quả kinh tế cao hơn.
3.3.3. Xác định sự có mặt của fucoidan và độ tinh sạch của fucoidan trong sản phẩm
Tiến hành đo phổ HNMR đối với 3 mẫu fucoidan thu được từ 3 mẫu rong nâu S. mcclurei, S.polycystum, S.oligocystum tại Khánh Hòa theo phương pháp xay chiết mới để khẳng định sản phẩm thu được là fucoidan và kiểm tra độ tinh sạch của fucoidan. Kết quả thu được thể hiện ở hình 3.16.
S.mcclurei (M1)
S.polycystum (M4)
Hình 3.16. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của các mẫu fucoidan thu
từ 3 loài rong nâu S.mcclurei, S.polycystum, S.oligocystum
Nhận xét:
Từ kết quả sắc ký đồ của các mẫu fucoidan từ 3 loài rong nâu S.mcclurei, S.polycystum, S.oligocystum được thể hiện trong hình 3.16, cho thấy phổ HNMR của 2 mẫu fucoidan M1, M3 được đo và xác định tại Viện sinh hóa Thái Bình Dương - Vladivostok - Viện Hàn lâm Nga (báo cáo tổng kết đề tài “Nghiên cứu qui trình và thiết bị sản xuất fucoidan từ rong nâu Việt Nam qui mô pilot” của Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang). Đây là cơ sở dữ liệu được lưu trữ theo kết quả nghiên cứu trước đây, được công bố kèm theo phương pháp kiểm của Nhut.ND. (PP2) [10].
Phổ HNMR của 3 mẫu fucoidan M2, M4, M5 là sản phẩm fucoidan được chúng tôi tinh chế và tiến hành đo mẫu ở phổ 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) đo trên máy Bruker AVANCE 500 tại Viện Hóa học. Tetrametylsilan (TMS) (cho 1H) hoặc tín hiệu dung môi (cho 13C) được dùng làm nội chuẩn. Các mẫu fucoidan được đo với D2O/0,1% CF3COOD. 3 mẫu này được đo mà không sử dụng lại cơ sở dữ liệu vì trước đây phương pháp này chưa được dùng để xác định fucoidan từ các loài rong nâu Việt Nam nên chưa có dữ liệu lưu trữ.
Mặc dù tín hiệu của các pic có độ lớn nhỏ khác nhau, nhưng phân bố các pic theo độ dịch chuyển hóa học là như nhau. Các tín hiệu đặc trưng của nhóm methyl trong methylpentose vùng 1,0 đếm 1,5 ppm và tín hiệu proton alpha vùng 5,0 đến 5,5 ppm đã chứng tỏ sự có mặt của fucoidan trong sản phẩm. Điều này chứng tỏ, sản phẩm chúng tôi thu được từ phương pháp mới là fucoidan, các tín hiệu nhận biết fucoidan vùng 1,0 đến 1,5 ppm cũng như vùng 5,0 đến 5,5 ppm của M2, M4 và M5 rõ ràng hơn của M1 và M3, điều này chứng tỏ M2, M4 và M5 tinh sạch hơn M1 và M3.
Như vậy, theo kết quả phân tích sắc ký đồ của các sản phẩm thu từ 3 loài rong nâu S.mcclurei, S.polycystum, S.oligocystum theo phương pháp mới là fucoidan và
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN
1. KẾT LUẬN:
Từ các nghiên cứu ở trên cho phép rút ra một số kết luận như sau:
1. Đã sơ bộ xác định được thành phần hóa học chính của 3 loài rong nâu nguyên liệu S.mcclurei, S.polycystum, S.oligocystum và nhận thấy đối với 3 loài Sargassum
đang khảo sát, hàm lượng alginic axit dao động từ 11 đến 20%, laminaran từ 4,2 đến
4,82% so với trọng lượng khô.
2. Đã tiến hành sử dụng các phương pháp khác nhau để định lượng fucoidan thu
từ rong nâu và thử nghiệm đánh giá hàm lượng fucoidan thu được từ 3 loài rong nâu S.mcclurei, S.polycystum, S.oligocystum ở Khánh Hòa và nhận thấy phương pháp 3
[25] cho kết quả chính xác nhất và đơn giản nhất. Kết quả định lượng được hàm
lượng fucoidan thu từ 3 loài rong S.mcclurei, S.polycystum, S.oligocystum bằng PP3 cho thấy hàm lượng fucoidan thu từ rong nâu S. polycystum cao nhất và đạt