Theo nội dung 1 của đề tài cần phải thực hiện, tiến hành tách chiết fucoidan theo 3 phương pháp:
- Qui trình chiết của Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang của nhóm tác giả Bùi Minh Lý, Nguyễn Duy Nhứt và các cộng sự
- Qui trình chiết theo Bản quyền WO2005014657 của các tác giả Zvyagintseva, Mikailovna, Tatyan
- Qui trình chiết theo Bản quyền EP0645143A1 của các tác giả Kimura Itsuko (JP); Shibata Hideyuki (JP).
Trên cơ sở phương pháp định lượng fucoidan đã xác định được ở trên đánh giá khả năng thu nhận fucoidan của mỗi phương pháp.
2.2.2.1. Qui trình chiết fucoidan của Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ
Nha Trang.
Hình 2.1. Qui trình chiết fucoidan của Viện Nghiên cứu và Ứng dụng
Công nghệ Nha Trang.
Qui trình được công bố tại hội nghị khoa học kỷ niệm 35 năm ngày thành lập Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam tại Hà Nội tháng 10 năm 2010, tiểu ban các chất có hoạt tính sinh học ISBN 978-604-913-012-0:
Từ rong khô qua máy cắt rong, tiến hành cắt rong với kích thước 2-5mm. Bỏ toàn bộ rong đã cắt vào nồi chiết, ở nhiệt độ phòng, bổ sung dung dịch HCl 2N. Sau khi chiết xong, hỗn hợp gồm dịch chiết và bã rong. Tiến hành lọc qua vải, bã rong tách ra dùng sản xuất alginate, còn dịch chiết thô 1 lọc qua lớp diatomit 700 mesh, dày 2 cm ta thu được dịch lọc thô 2. Cho dịch lọc thô 2 lọc qua màng 25 m, thu được dịch lọc thô 3 và nước. Dịch lọc thô 3 được cô đặc bằng máy siêu lọc 100kDa, những chất có phân tử lượng thấp như muối, màu, kim loại, nước được tách ra khỏi dung dịch. Dịch còn lại tiến hành bổ sung cồn, NaOH, NaCl, ta thu được kết tủa fucoidan tại pH=6. Tiến hành ly tâm tách chất màu, muối, cồn, nước ra khỏi hỗn hợp, ta thu được fucoidan nguyên chất. Tiến hành sấy phun ở nhiệt độ nhỏ hơn 700C ta thu được fucoidan dạng bột.
2.2.2.2. Qui trình chiết theo WO2005014657 [67]
“PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ RONG BIỂN”
1)25kg rong tươi sau khi làm sạch sơ bộ được chiết với ethanol theo tỉ lệ 1:1 (khối lượng/thể tích) trong 22 giờ ở 500C. Dịch chiết ethanol được tách ra và cho bay
hơi bằng cô quay chân không, ethanol để sử dụng lại, chất khô là hỗn hợp các chất phân tử lượng thấp có hoạt tính sinh học.
2)Bã rong được chiết với dung dịch axit clohydric loãng 0,1M trong 12 giờ ở 250C có khuấy trộn. Dịch chiết được tách ra và cho chạy qua siêu lọc màng 5kDa đến thể tích còn lại 1/5 ban đầu, tiếp tục trung hoà đến pH=6 với natri hidroxyt và cho bay hơi đến còn 1lít. Đây là phân đoạn chiết đầu tiên gồm có laminaran và fucoidan. Hai lần thể tích etanol 96% (v/v) được đưa vào, kết tủa được rửa sạch với etanol 96% (v/v) và làm khô.
3)Dịch chiết sau khi bổ sung hai lần thể tích etanol đã tách ra fucoidan được bổ sung thêm hai lần thể tích etanol một lần nữa, laminaran được tiếp tục tách ra dưới dạng tủa. Kết tủa được ly tâm, rửa sạch bằng etanol 96% (v/v) và làm khô.
4)Bã rong còn lại được chiết với nước nóng ở pH=3,5 - 4 trong 3 giờ, sau đó 1 lần nữa trong 1,5 giờ. Dịch chiết được cô lại còn 1/10 thể tích ban đầu bằng màng siêu lọc 15 kDa, tiếp tục cho bay hơi bằng cô quay chân không đến thể tích còn 1 lít. Dịch chiết được bổ sung HCl đến pH=2, polymanuronic axit được tách ra dưới dạng kết tủa và được ly tâm lấy ra. Kết tủa được hoà tan lại trong NaOH 1M, dịch trung tính của natri polymanuronat được kết tủa bằng hai thể tích ethanol 96% (v/v), được rửa bằng ethanol 96% (v/v) và làm khô.
5)Dịch sau khi đã tủa polymanuronic axit được trung hoà kết tủa và rửa với ethanol 96% (v/v) sau đó làm khô, thu được fucoidan (F2).
6)Tiếp tục đưa hai thể tích ethanol 96% (v/v) vào dịch đã tủa fucoidan kết tủa được tạo thành, ly tâm rửa với ethanol 96% (v/v) làm khô, thu được laminaran (L2).
7)Bã rong được tiếp tục xử lý với dung dịch natri bicarbonate và chiết trong 3 giờ ở nhiệt độ 650C. Dịch chiết được cô cạn bằng màng siêu lọc 100kDa, sau đó được trung hoà và đưa vào hai thể tích ethanol 96% (v/v) polysaccharides tạo thành được rửa với ethanol 96% (v/v) và được làm khô.
Mục tiêu của luận văn là chỉ tách chiết fucoidan nên thí nghiệm được dừng lại sau khi thực hiện xong bước 2, các bước từ 3 cho đến hết sẽ được tiến hành trong các nghiên cứu tiếp theo về sau.
2.2.2.3. Qui trình theo bản quyền EP0645143A1 [30]
“TÁC NHÂN CHỐNG UNG THƯ VÀ ĐAU DẠ DÀY”
Hình 2.2. Qui trình chiết fucoidan theo bản quyền EP0645143A1
Qui trình 1:
Huyền phù nước: rong là 3:1, đun nóng ở 1000C từ 10 đến 60 phút. Tiến hành ly tâm loại bỏ bã rong, ta thu được dịch. Tiến hành bổ sung Ca2Cl 0,5 đến 1 g/l. Alginate canxi tách ra, ta tiến hành ly tâm loại bỏ alginic axit đã chuyển thành alginate canxi. Chạy qua siêu lọc 3 lần, mỗi lần với 10 lần thể tích nước cất để loại bỏ muối, chất màu. Tiến hành đông khô hoặc kết tủa bằng cồn và tiến hành sấy chân không, ta thu được fucoidan.
Huyền phù nước : rong = 3
Đun nóng ở 100oC 10 đến 60 phút.
Ly tâm loại bỏ bã rong
+ CaCl2 đạt 0,5 đến 1g/l. Ly tâm loại bỏ alginic axít (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chạy qua siêu lọc 3 lần, mỗi lần với 10 lần thể tích nước cất
Đông khô
hoặc tạo kết tủa với 2 lần thể tích EtOH
Sấy chân không
Fucoidan Huyền phù dd HCl : rong = 3 pH=2 Đun nóng 25- 100oC 10 đến 60 phút. Ly tâm loại bỏ bã rong + CaCl2 đạt 0,5 đến 1g/l. Ly tâm loại bỏ alginic axít
Chạy qua siêu lọc 3 lần, mỗi lần với 10 lần thể tích nước cất
Đông khô
hoặc tạo kết tủa với 2 lần thể tích EtOH
Sấy chân không
Qui trình 2:
Huyền phù HCl: rong là 3:1, đun nóng ở 25-1000C từ 10 đến 60 phút. Tiến hành ly tâm loại bỏ bã rong, ta thu được dịch. Tiến hành bổ sung CaCl2 0,5 đến 1 g/l. Alginate canxi tách ra, ta tiến hành ly tâm loại bỏ alginic axit đã chuyển thành alginate canxi. Chạy qua siêu lọc 3 lần, mỗi lần với 10 lần thể tích nước cất để loại bỏ muối, chất màu. Tiến hành đông khô hoặc kết tủa bằng cồn và tiến hành sấy chân không, ta thu được fucoidan.